Richtlinie 9269EWG der Kommission vom 31. Juli 1992 zur siebzehnten Anpassung ...

Online-Shop für Schriften

Jetzt bei uns im Shop bestellen

Jetzt bestellen
31992L0069 - Richtlinie 1992/69/EWG
Richtlinie 92/69/EWG der Kommission vom 31. Juli 1992 zur siebzehnten Anpassung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften für die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe an den technischen Fortschritt
EU-Recht
Titel: Richtlinie 92/69/EWG der Kommission vom 31. Juli 1992 zur siebzehnten Anpassung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften für die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe an den technischen Fortschritt
Normgeber: EU
Redaktionelle Abkürzung: 31992L0069
Gliederungs-Nr.: [keine Angabe]
Normtyp: Europäische Akte

Richtlinie 92/69/EWG der Kommission vom 31. Juli 1992 zur siebzehnten Anpassung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften für die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe an den technischen Fortschritt

OJ-L 383 vom 29.12.1992, S. 0113 - 0114

(CELEX Nummer 31992L0069)

Link zum Dokument

- originaler Rechtsakt -

Daten

Datum des Dokuments:

31.07.1992

 

Datum des Inkrafttretens:

01.01.1777

Datum der Zustellung

Datum der Benachrichtigung:

01.01.1777

 

Außerkrafttreten:

  

Datum der Umsetzung:

30.10.1993

Spätestens Siehe Art 3

Datum der Unterzeichnung:

  

Verbindliche Sprache

Französisch, Isländisch, Norwegisch, Dänisch, Spanisch, Englisch, Griechisch, Portugiesisch, Italienisch, Deutsch, Niederländisch

Klassifikation

EUROVOC-Deskriptor:

Etikettierung

gefährlicher Stoff

Klassifikation

Verpackung

Angleichung der Rechtsvorschriften

Sachgebiet:

Verbraucherschutz

Umwelt

Angleichung der Rechtsvorschriften

Technische Handelshemmnisse

Binnenmarkt - Grundsätze

Code Fundstellennachweis:

Industriepolitik und Binnenmarkt; Binnenmarkt: Angleichung der Rechtsvorschriften; Gefährliche Stoffe

Sonstige Informationen

Autor:

Europäische Kommission

Form:

Richtlinie

Adressat:

Die Mitgliedstaaten

Ergänzende Informationen:

Ausdehnung auf den EWR 21994D0628(01) Richtlinie zur Änderung

Verfahren

Verbindungen zwischen Dokumenten

Vertrag:

Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft (1957)

Rechtsgrundlage:

31967L0548

Art. 28

Art. 29

Geänderte Rechtsakte:

Alle konsolidierten Fassungen:

Die Rechtsakte betreffendes Urteil:

Zitierte Rechtsakte:

31988L0379

31986L0609

31992L0069

Richtlinie 92/69/EWG der Kommission vom 31. Juli 1992 zur siebzehnten Anpassung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften für die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe an den technischen Fortschritt


RICHTLINIE 92/69/EWG DER KOMMISSION vom 31. Juli 1992 zur siebzehnten Anpassung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften für die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe an den technischen Fortschritt

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft,

gestützt auf die Richtlinie 67/548/EWG des Rates vom 27. Juni 1967 zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften für die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe (1), zuletzt geändert durch die Richtlinie 92/32/EWG (2), insbesondere auf die Artikel 28 und 29, in Erwägung nachstehender Gründe:

(1) ABl. Nr. 196 vom 16. 8. 1967, S. 1.

(2) ABl. Nr. L 154 vom 5. 6. 1992, S. 1.

Nach Artikel 3 Absatz 1 der Richtlinie 67/548/EWG und Artikel 3 der Richtlinie 88/379/EWG des Rates vom 7. Juni 1988 zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften für die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe (3), zuletzt geändert durch die Richtlinie 90/492/EWG der Kommission (4), erfolgt die Bestimmung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Stoffe und Zubereitungen sowie ihrer Toxizität und Ökotoxizität nach den in Anhang V der Richtlinie 67/548/EWG vorgesehenen Methoden.

(3) ABl. Nr. L 187 vom 16. 7. 1988, S. 14.

(4) ABl. Nr. L 275 vom 5. 10. 1990, S. 35.

Anhang V der Richtlinie 67/548/EWG wird zur Zeit in zwei Teilen veröffentlicht; diese bilden den Anhang zur Richtlinie 84/449/EWG der Kommission (5) bzw. 88/302/EWG der Kommission (6).

(5) ABl. Nr. L 251 vom 19. 9. 1984, S. 1.

(6) ABl. Nr. L 133 vom 30. 5. 1988, S. 1, und ABl. Nr. L 136 vom 2. 6. 1988, S. 20.

Um der technischen Entwicklung Rechnung zu tragen, müssen die im Anhang der Richtlinie 84/449/EWG anzugebenden Prüfmethoden überarbeitet werden.

Zur Berücksichtigung der technischen Entwicklung ist auch das im Anhang der Richtlinie 88/302/EWG genannte Verfahren zur Prüfung der Wachstumshemmung bei Algen zu überarbeiten und in den Anhang der Richtlinie 84/449/EWG aufzunehmen.

Die Zahl der für Versuchszwecke eingesetzten Tiere sollte nach der Richtlinie 86/609/EWG des Rates vom 24. November 1986 zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften der Mitgliedstaaten zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere (7) auf ein Minimum beschränkt werden.

(7) ABl. Nr. L 358 vom 18. 12. 1986, S. 1.

Die Vorschriften dieser Richtlinie entsprechen der Stellungnahme des Ausschusses zur Anpassung der Richtlinie zur Beseitigung der technischen Hemmnisse im Handel mit gefährlichen Stoffen und Zubereitungen an den technischen Fortschritt -

HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN:

Artikel 1

Der Anhang der Richtlinie 84/449/EWG wird durch den Anhang dieser Richtlinie ersetzt.

Artikel 2

Das im Anhang der Richtlinie 88/302/EWG festgelegte Verfahren zur Prüfung der Wachstumshemmung bei Algen wird gestrichen.

Artikel 3

Die Mitgliedstaaten erlassen die erforderlichen Rechts- und Verwaltungsvorschriften, um dieser Richtlinie bis spätestens 30. Oktober 1993 nachzukommen. Sie setzen die Kommission unverzueglich davon in Kenntnis.

Wenn die Mitgliedstaaten diese Vorschriften erlassen, nehmen sie in diesen Vorschriften selbst oder bei der amtlichen Veröffentlichung auf diese Richtlinie Bezug. Sie regeln die Einzelheiten dieser Bezugnahme.

Artikel 4

Diese Richtlinie ist an die Mitgliedstaaten gerichtet.

Brüssel, den 31. Juli 1992

Für die Kommission

Karel VAN MIERT

Mitglied der Kommission

ANHANG

Dieser Anhang wird im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften Nr. L 383 A veröffentlicht.

(Siehe "Hinweis" auf der dritten Umschlagseite dieses Amtsblatts)

Anhang zur Richtlinie 92/69/EWG der Kommission vom 31. Juli 1992 zur siebzehnten Anpassung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften für die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe an den technischen Fortschritt

(1) INHALTSVERZEICHNIS

EINLEITUNG

TEIL A: METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER PHYSIKALISCH-CHEMISCHEN EIGENSCHAFTEN //5

A.1. Schmelz-/Gefriertemperatur //5

A.2. Siedetemperatur //15

A.3. Relative Dichte //21

A.4. Dampfdruck //26

A.5. Oberflächenspannung //47

A.6. Wasserlöslichkeit //54

A.8. Verteilungsköffizient //63

A.9. Flammpunkt //74

A.10. Entzuendlichkeit (Feste Stoffe) //76

A.11. Entzuendlichkeit (Gase) //79

A.12. Entzuendlichkeit (Berührung mit Wasser) //81

A.13. Pyrophore Eigenschaften von Festen und Flüssigen Stoffen //85

A.14. Explosionsgefahr //87

A.15. Zuendtemperatur (Flüssigkeiten und Gase) //98

A.16. Relative Selbstentzuendungstemperatur für Feststoffe //99

A.17. Brandfördernde Eigenschaften (Feststoffe) //102

TEIL B: METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER TOXIZITÄT //107

Allgemeine Einleitung //107

B.1. Akute Toxizität (oral) //110

B.1 bis Akute Toxizität (oral) (Fest-Dosis-Methode) //113

B.2. Akute Toxizität (Inhalation) //117

B.3. Akute Toxizität (dermal) //121

B.4. Akute Toxizität (Hautreizung) //124

B.5. Akute Toxizität (Augenreizung) //127

B.6. Sensibilisierung der Haut //131

B.7. Toxizität nach 28-tägiger Gabe (oral) //136

B.8. Toxizität nach 28-tägiger Gabe (Inhalation) //140

B.9. Toxizität nach 28-tägiger Gabe (dermal) //144

B.10. Mutagenität (Säuger zytogenetischer in vitro-Test) //148

B.11. Mutagenität (Säuger Knochenmark - zytogenetischer in vivo-Test, Chromosomenanalyse) //151

B.12. Mutagenität (Mikrokerntest) //154

B.13. Mutagenität (Escherichia coli - Rückmutationsversuch) //157

B.14. Mutagenität (Salmonella typhimurium - Rückmutationsversuch) //160

TEIL C: METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER ÖKOTOXIZITÄT //163

C.1. Akute Toxizität für Fische //163

C.2. Akute Toxizität für Daphnien //172

C.3. Algeninhibitiontest //179

C.4. Bestimmung der "leichten" biologischen Abbaubarkeit: //187

C.4-A: Abbau von gelöstem organischem Kohlenstoff (DOC) //194

C.4-B: Modifizierter ÖCD-Screening-Test //197

C.4-C: Entwicklung von CO2 //202

C.4-D: Manometrischer Respirationstest //207

C.4-E: Geschlossener Flaschentest //211

C.4-F: MITI.Test (Ministry of International Trade and Industry - Japan) //216

Anhänge //221

C.5. Abbaubarkeit - Biochemischer Sauerstoffbedarf //226

C.6. Abbaubarkeit - Chemischer Sauerstoffbedarf //227

C.7. Abbaubarkeit - Abiotischer Abbau - Hydrolyse in Abhängigkeit vom pH //229

EINLEITUNG

In diesem Anhang werden die Methoden zur Bestimmung der physikalisch-chemischen, toxikologischen und ökotoxikologischen Eigenschaften gemäß den Anhängen VII und VIII der Richtlinie 79/831/EWG beschrieben. Diese beruhen auf Methoden, die von den zuständigen internationalen Stellen (insbesondere der ÖCD) anerkannt und empfohlen worden sind.

Wo keine solchen Methoden verfügbar waren, sind einzelstaatliche Normen oder von den Wissenschaftlern vereinbarte Methoden gewählt worden. Generell sollten die Versuche mit den von der Richtlinie festgelegten Stoffen durchgeführt werden. Beachtung ist dem möglichen Einfluß von Verunreinigungen auf die Ergebnisse beizumessen.

Wenn die Methoden dieses Anhanges nicht geeignet für die Untersuchung einer bestimmten Eigenschaft sind, muß der Anmelder die alternativ benutzte Methode begründen.

Die Tierversuche sind in Übereinstimmung mit den einzelstaatlichen Bestimmungen durchzuführen und sollten humanen Kriterien und den neuesten internationalen Erkenntnissen im Bereich der Tiergesundheit Rechnung tragen.

Bei gleichwertigen Prüfmethoden ist nur diejenige anzuwenden, die die geringeren Tieropfer fordert.

TEIL A: METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER PHYSIKALISCH-CHEMISCHEN EIGENSCHAFTEN

A.1. SCHMELZ-/GEFRIERTEMPERATUR

1. METHODEN

Den meisten der hier beschriebenen Methoden liegt die ÖCD-Prüfrichtlinie (1) zugrunde. Die Grundprinzipien sind in (2) und (3) angegeben.

1.1. EINLEITUNG

Die hier beschriebenen Methoden und Geräte sind zur Bestimmung der Schmelztemperatur der Substanzen ohne jede Einschränkung in bezug auf ihren Reinheitsgrad anzuwenden.

Die Wahl der bestgeeigneten Methode hängt von der Natur der Prüfsubstanz ab. Die Anwendbarkeit ist davon abhängig, ob sich der betreffende Stoff leicht, schwierig oder überhaupt nicht pulverisieren lässt.

Für bestimmte Stoffe bietet sich eher eine Bestimmung der Gefrier- oder Erstarrungstemperatur an: folglich wurden Vorschriften für diese Bestimmungen gleichfalls in diese Methodik aufgenommen.

Wo sich aufgrund der besonderen Eigenschaften des Stoffes keiner der oben genannten Parameter ohne weiteres messen lässt, kann die Messung eines Stockpunktes angebracht sein.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Als Schmelztemperatur bezeichnet man diejenige Temperatur, bei der unter atmosphärischem Druck der Übergang zwischen fester und fluessiger Phase stattfindet; unter idealen Bedingungen entspricht diese Temperatur der Gefriertemperatur.

Da bei vielen Stoffen der Phasenübergang in einem Temperaturbereich stattfindet, wird dieser Übergang auch oft als Schmelzbereich bezeichnet.

Umrechnung der Einheiten (K in C):

t = T 273,15

t: Celsius-Temperatur, in Grad Celsius ( C)

T: Thermodynamische Temperatur, Kelvin (K)

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Referenzsubstanzen müssen nicht in allen Fällen verwendet werden, in denen eine neue Prüfsubstanz untersucht wird. Die Referenzsubstanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.

Einige der Eichsubstanzen sind in der Literatur (4) zu finden.

1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE

Man bestimmt die Temperatur (den Temperaturbereich) der Phasenumwandlung vom festen in den fluessigen Zustand oder vom fluessigen in den festen Zustand. In der Praxis wird eine Probe der zu untersuchenden Substanz bei Atmosphärendruck erhitzt/abgekühlt und dabei die Temperaturen des Schmelz-/Gefrierbeginns sowie des vollständigen Schmelzens/Gefrierens bestimmt. Fünf Typen von

Methoden werden beschrieben: Kapillarmethode, Heiztischmethode, Gefriertemperaturbestimmungen, Methoden der thermischen Analyse und Bestimmung des Stockpunktes (entwickelt für Erdöl).

In einigen Fällen kann es von Nutzen sein, statt der Schmelztemperatur die Gefriertemperatur zu messen.

1.4.1. Die Kapillarmethode

1.4.1.1. Schmelztemperaturgeräte mit Flüssigkeitsbad

Eine geringe Menge der fein zerriebenen Substanz wird in ein Kapillarröhrchen gegeben und durch Klopfen verdichtet. Das Röhrchen wird zusammen mit einem Thermometer erhitzt und dabei der Temperaturanstieg so eingestellt, daß er während des eigentlichen Schmelzvorgangs weniger als 1 K pro Minute beträgt. Man notiert die Temperaturen bei Schmelzbeginn und bei Schmelzende.

1.4.1.2. Schmelztemperaturgeräte mit Metallblock

Wie in 1.4.1.1, jedoch mit dem Unterschied, daß das Kapillarröhrchen und das Thermometer in einem erwärmten Metallblock befestigt sind und sich durch Öffnungen in dem Block beobachten lassen.

1.4.1.3. Bestimmung mit Photozelle

Die in dem Kapillarröhrchen befindliche Substanzprobe wird in einem Metallzylinder automatisch erwärmt. In dem Zylinder befindet sich eine Öffnung, und ein gebündelter Lichtstrahl wird auf diesem Wege durch die Probe auf eine genauestens geeichte Photozelle gerichtet. Die optischen Eigenschaften der meisten Substanzen ändern sich beim Schmelzen von opak nach durchsichtig. In diesem Augenblick steigt also die Lichtintensität in der Photozelle, und ein Stopsignal wird zur Digitalanzeige übertragen, die die Temperatur des in der Heizkammer befindlichen Platin-Widerstandsthermometers anzeigt. Allerdings eignet sich diese Methode nicht für einige stark gefärbte Substanzen.

1.4.2. Heiztische

1.4.2.1. Kofler-Heizbank

Die Wirkungsweise der Kofler-Heizbank beruht auf zwei elektrisch beheizten Metallblöcken unterschiedlicher Wärmeleitfähigkeit, wobei die Bank selbst so ausgelegt ist, daß auf ihrer gesamten Länge ein fast linearer Temperaturgradient herrscht. Der Temperaturbereich der Heizbank liegt im allgemeinen zwischen 283 K und 573 K. Die Bank verfügt über eine spezielle Temperaturableseeinrichtung, bestehend aus einem Zeiger und einer für die jeweilige Heizbank ausgelegten Skala. Zur Schmelztemperaturbestimmung wird die betreffende Substanz in einer dünnen Schicht direkt auf die Oberfläche der Heizbank aufgebracht. In wenigen Sekunden zeichnet sich eine scharfe Trennlinie zwischen der fluessigen und der festen Phase ab. Zur Ablesung der Temperatur wird der Zeiger auf die Trennlinie eingestellt.

1.4.2.2. Das Schmelzmikroskop

Zur Schmelztemperaturbestimmung mit sehr kleinen Stoffmengen sind verschiedene Heiztische mit Mikroskop im Gebrauch. Die meisten Heiztische bedienen sich zur Temperaturablesung empfindlicher Thermölemente, doch werden gelegentlich auch Quecksilberthermometer verwendet. Das typische Schmelztemperaturbestimmungsgerät mit Heiztisch besitzt eine Heizkammer mit einer Metallplatte, auf welcher die auf einem Objektträger befindliche Probe angebracht wird. Durch eine Öffnung im Mittelpunkt der Metallplatte wird über den Beleuchtungsspiegel des Mikroskops ein Lichtbündel gerichtet. Bei Messungen wird die Heizkammer durch eine Glasplatte abgedeckt, damit der Probenbereich vor Lufteinfluessen geschützt wird.

Das Aufheizen der Probe wird durch einen Regelwiderstand kontrolliert. Für sehr genaue Messungen an optisch anisotropen Substanzen kann polarisiertes Licht verwendet werden.

1.4.2.3. Die Meniskusmethode

Diese Methode wird vor allem für Polyamide angewandt.Die Temperatur, bei der sich ein zwischen dem Heiztisch und einem durch die Polyamidprobe getragenen Deckglas eingeschlosser Silikonölmeniskus verlagert, wird visuell bestimmt.

1.4.3. Methode zur Bestimmung der Gefriertemperatur

Die Probe wird in ein dazu bestimmtes Reagenzglas gefuellt und in ein Gerät zur Bestimmung der Gefriertemperatur gestellt. Während des Abkühlens wird die Probe langsam und kontinuierlich gerührt und die Temperatur in geeigneten Zeitabständen gemessen. Diejenige Temperatur, korrigiert um den Thermometerfehler, bei der der Temperaturverlauf während einiger Ablesungen konstant bleibt, wird als Gefriertemperatur notiert.

Eine Unterkühlung ist durch Erhalt des Gleichgewichts zwischen der festen und der fluessigen Phase zu vermeiden.

1.4.4. Thermische Analyse

1.4.4.1. Differentialthermoanalyse (DTA)

Mit diesem Verfahren wird der Temperaturunterschied zwischen der Substanz und einem Referenzmaterial in Abhängigkeit von der Temperatur aufgezeichnet, während die Substanz und das Referenzmaterial demselben kontrollierten Temperaturprogramm ausgesetzt werden. Wenn die Probe eine Phasenumwandlung mit Änderung der Enthalpie durchläuft, dann wird diese Änderung durch ein endothermes (Schmelzen) oder exothermes (Gefrieren) Abweichen vom Ausgangsniveau der Temperaturaufzeichnung angezeigt.

1.4.4.2. Differentialscanningkalorimetrie (DSK)

Mit diesem Verfahren wird der Unterschied in der Energieaufnahme zwischen einer Substanz und einem Referenzmaterial in Abhängigkeit von der Temperatur aufgezeichnet, während die Substanz und das Referenzmaterial demselben kontrollierten Temperaturprogramm ausgesetzt werden. Bei der Energie handelt es sich um diejenige Energie, die notwendig ist, um einen Temperaturabgleich zwischen der Substanz und dem Referenzmaterial zu erreichen. Wenn die Probe eine Phasenumwandlung mit Änderung der Enthalpie durchläuft, dann wird diese Änderung durch ein endothermes (Schmelzen) oder exothermes (Gefrieren) Abweichen vom Ausgangsniveau des Wärmeflußbildes angezeigt.

1.4.5. Stockpunkt

Dieses Verfahren wurde zur Verwendung bei Erdölen entwickelt; es eignet sich für ölige Substanzen mit einer niedrigen Schmelztemperatur.

Die Probe wird nach vorherigem Aufheizen mit einer bestimmten Geschwindigkeit abgekühlt und in Abständen von 3 K auf ihre Fließeigenschaften untersucht. Die niedrigste Temperatur, bei der noch eine Bewegung der Substanz beobachtet wird, wird als Stockpunkt notiert.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Der Anwendungsbereich und die Genauigkeit der verschiedenen Methoden zur Bestimmung von Schmelztemperatur/Schmelzbereich sind nachstehender Tabelle zu entnehmen:

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODEN

Die Durchführung fast aller hier aufgeführten Prüfmethoden ist in nationalen und internationalen Normen beschrieben (siehe Anlage 1).

1.6.1. Methoden mit Kapillarrohr

Fein pulverisierte Substanzen lassen im Verlauf eines langsamen Temperaturanstiegs im allgemeinen die in Abbildung 1 dargestellten Schmelzstadien erkennen.

Abbildung 1

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Stadium A (Schmelzbeginn): Feine Tröpfchen haften gleichmässig an der Innenwand des Kapillarrohrs.

Stadium B Aufgrund des Schrumpfens der Probe bildet sich zwischen Innenwand und Probe ein klarer Flüssigkeitsfilm.

Stadium C Die geschrumpfte Probe beginnt nach unten zusammenzufallen und wird fluessig.

Stadium D An der Oberfläche bildet sich ein vollständiger Meniskus, aber ein erheblicher Teil der Probe ist noch fest.

Stadium E (Endstadium des Schmelzens): Die Probe enthält keine festen Teilchen mehr.

Während der Bestimmung der Schmelztemperatur werden die Temperaturen zu Beginn und zu Ende des Schmelzvorgangs registriert.

1.6.1.1. Schmelztemperaturbestimmungsgeräte mit Flüssigkeitsbad

Abbildung 2 zeigt eine genormte Glasapparatur zur Bestimmung der Schmelztemperatur (JIS K 0064). Alle Dimensionsangaben in mm.

Abbildung 2

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

A: Meßkolben

B: Stopfen

C: Druckausgleich

D: Thermometer

E: Hilfsthermometer

F: Badfluessigkeit

G: Kapillarrohr aus Glas, 80 bis 100 mm lang mit einem inneren Durchmesser von 1,0 mm 0,2 mm und einer Wandstärke von 0,2 bis 0,3 mm

H: seitlicher Stutzen

Die Badfluessigkeit: Es sollte eine geeignete Flüssigkeit gewählt werden. Die Wahl der Flüssigkeit hängt von der zu bestimmenden Schmelztemperatur ab, z.B. fluessiges Paraffin für Schmelztemperaturen nicht über 473 K, Silikonöl für Schmelztemperaturen nicht über 573 K.

Für Schmelztemperaturen über 523 K kann eine Mischung aus drei Gewichtsteilen Schwefelsäure und zwei Gewichtsteilen Kaliumsulfat benutzt werden. Bei Verwendung einer solchen Mischung sollten geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.

Thermometer: Es sollten nur solche Thermometer verwendet werden, die den Anforderungen der nachstehenden oder anderer gleichwertiger Normen entsprechen:

ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Durchführung: Die getrocknete Substanz wird in einem Mörser fein zerrieben und anschließend in ein an einem Ende zugeschmolzenes Kapillarröhrchen gefuellt. Nach Verdichten durch Klopfen sollte die Füllhöhe etwa 3 mm betragen. Zu diesem Zweck lässt man das Kapillarröhrchen aus ca. 700 mm Höhe durch ein Glasrohr auf ein Uhrglas fallen.

Das gefuellte Kapillarröhrchen wird derart in das Bad eingebracht, daß der mittlere Teil der Quecksilberkugel des Thermometers das Kapillarröhrchen an der Stelle berührt, an der sich die Probe befindet. Gewöhnlich führt man das Kapillarröhrchen etwa 10 K vor Erreichen der Schmelztemperatur in das Gerät ein.

Das Flüssigkeitsbad wird so beheizt, daß der Temperaturanstieg etwa 3 K pro Minute beträgt. Dabei soll die Flüssigkeit gerührt werden. Etwa 10 K vor Erreichen der erwarteten Schmelztemperatur wird der Temperaturanstieg auf maximal 1 K pro Minute reduziert.

Berechnung: Die Berechnung der Schmelztemperatur wird folgendermassen durchgeführt:

T = TD+0,00016(TD TE) n

Darin bedeuten:

T = korrigierte Schmelztemperatur in K

TD = Temperaturablesung am Thermometer D in K

TE = Temperaturablesung am Thermometer E in K

n = Anzahl der Grade, die der Quecksilberfaden des Thermometers D aus der Flüssigkeit herausragt.

1.6.1.2. Schmelztemperaturbestimmungsgeräte mit Flüssigkeitsbad

Das Gerät

Das Gerät besteht aus:

- einem zylindrischen Metallblock, dessen oberer Teil hohl ist und eine Heizkammer bildet (vgl. Abbildung 3),

- einer Abdeckplatte aus Metall mit zwei oder mehreren Öffnungen, durch welche die Schmelzpunktröhrchen in den Metallblock eingebracht werden können,

- einem Heizsystem für den Metallblock, beispielsweise mit einem in den Metallblock eingeschlossenen elektrischen Heizwiderstand,

- einem Regelwiderstand zur Regulierung der Leistungsaufnahme bei elektrischer Heizung,

- vier Fenstern aus hitzebeständigem Glas, die sich an den Seitenwänden der Heizkammer rechtwinklig gegenüberliegen. Vor einem dieser Fenster befindet sich ein Okular zur Beobachtung des Kapillarröhrchens. Die drei anderen Fenster dienen zur Beleuchtung des Innenraumes mittels Lampen,

- und einem an einem Ende zugeschmolzenen Kapillarröhrchen aus hitzebeständigem Glas (siehe 1.6.1.1.).

Thermometer:

Siehe die Normen in 1.6.1.1. Es können ebenfalls thermölektrische Meßgeräte mit vergleichbarer Genauigkeit verwendet werden.

Abbildung 3

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

1.6.1.3. Bestimmung mit Photozelle (automatisch)

Gerät und Verfahren:

Das Gerät besteht aus einer Metallkammer mit automatischer Heizvorrichtung. Drei Kapillarröhrchen werden nach 1.6.1.1. gefuellt und in die Heizkammer gestellt.

Zur Kalibrierung des Gerätes stehen mehrere lineare Temperaturanstiegsraten zur Verfügung; der geeignete Temperaturanstieg wird elektrisch auf eine im voraus festgelegte lineare Anstiegsrate gebracht. Die jeweilige Temperatur der Heizkammer und die Temperatur des in den Kapillarröhrchen enthaltenen Stoffes werden mit Registriergeräten aufgezeichnet.

1.6.2. Heiztische

1.6.2.1. Kofler-Heizbank

siehe Anlage.

1.6.2.2. Schmelzmikroskop

siehe Anlage.

1.6.2.3. Meniskusmethode (Polyamide)

siehe Anlage.

Im Bereich der Schmelztemperatur sollte die Heizgeschwindigkeit weniger als 1 K/min betragen.

1.6.3. Methoden zur Bestimmung der Gefriertemperatur

siehe Anlage.

1.6.4. Thermoanalyse

1.6.4.1. Differentialthermoanalyse

siehe Anlage.

1.6.4.2. Differentialscanningkalorimetrie

siehe Anlage.

1.6.5. Stockpunktbestimmung

siehe Anlage.

2. DATEN

In bestimmten Fällen ist eine Thermometeranpassung erforderlich.

3. ABSCHLUSSBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- verwendetes Verfahren;

- genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen), ggf. Vorreinigung;

- eine ungefähre Angabe zur Genauigkeit.

Der Mittelwert mindestens zweier Messungen, deren Werte im Bereich der ungefähren Genauigkeit (siehe Tabellen) liegen, ist als Schmelztemperatur anzugeben.

Liegt der Temperaturunterschied zwischen der Anfangs- und der Endphase des Schmelzens innerhalb der Genauigkeitsgrenzen der Methode, so ist die Anfangstemperatur als Schmelztemperatur anzugeben; andernfalls sind beide Temperaturen anzugeben.

Wenn sich der Stoff vor Erreichen der Schmelztemperatur zersetzt oder sublimiert, ist die Temperatur anzugeben, bei der dies beobachtet wird.

Alle zur Bewertung der Ergebnisse notwendigen Informationen und Bemerkungen sind zu notieren, insbesondere diejenigen über Verunreinigungen und den Aggregatzustand des Stoffes.

4. LITERATUR

(1) ÖCD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar (Hrsg.): Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II, 803-834.

(3) R. Weißberger (Hrsg.): Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.

(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogü of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.

Anlage

Weitere technische Einzelheiten können z.B. den folgenden Normen entnommen werden:

1. Kapillarmethoden

1.1. Schmelztemperaturbestimmungsgeräte mit Flüssigkeitsbad

ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals

BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range

DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalls von Harzen nach Kapillar-Verfahren

JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products

1.2. Schmelztemperaturbestimmungsgeräte mit Metallblock

DIN 53736 Visülle Bestimmung der Schmelztemperatur von teil-kristallinen Kunststoffen

ISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of "melting point"

2. Heiztische

2.1. Kofler-Heizbank

ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Schmelzmikroskop

DIN 53736 Visülle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3. Meniskusmethode (Polyamide)

ISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of "melting point"

ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials

NF T 51-050 Rsines de polyamides. Dtermination du "point de fusion". Mthode du mnisque

3. Methoden zur Gefriertemperaturbestimmung

BS 4633 Method for the determination of crystallizing point

BS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (Cooling Curve)

DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen

ISO 2207 Cires de ptrole: dtermination de la temprature de figeage

DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren

NF T 60-114 Point de fusion des paraffines

NF T 20-051 Mthode de dtermination du point de cristallisation (point de conglation)

ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Thermoanalyse

4.1. Differentialthermoanalyse

ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Differentialscanningkalorimetrie

ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Stockpunktbestimmung

NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du ptrole: Point de trouble et point d'coulement limite - Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Tröbelingspunt en vlöipunt

ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils

ISO 3016 Petroleum oils - Determination of pour point.

A.2. SIEDETEMPERATUR

1. METHODE

Den meisten der hier beschriebenen Methoden liegt die ÖCD-Prüfrichtlinie (1) zugrunde. Die Grundprinzipien sind in (2) und (3) angegeben.

1.1. EINLEITUNG

Die hier beschriebenen Methoden und Geräte können für fluessige und niedrig schmelzende Substanzen verwendet werden, wenn diese nicht unterhalb der Siedetemperatur chemisch reagieren (z.B. Autooxidation, Umlagerung, Zersetzung usw.). Die Methoden können auf reine und unreine Flüssikeiten angewendet werden.

Bevorzugt werden die Methoden mit Photozellen-Detektion und Thermoanalyse, da diese sowohl die Bestimmung der Schmelz- als auch der Siedetemperatur ermöglichen. Darüber hinaus können die Messungen automatisch durchgeführt werden.

Die "dynamische Methode" hat den Vorteil, daß sie auch zur Bestimmung des Dampfdrucks verwendet werden kann; dabei ist es nicht erforderlich, die Siedetemperatur auf den Normaldruck (101,325 kPa) zu berichtigen, da der Normdruck während der Messung durch einen Manostaten eingestellt werden kann.

Bemerkungen:

Der Einfluß von Verunreinigungen auf die Bestimmung der Siedetemperatur hängt weitgehend von der Art der Verunreinigung ab. Wenn hochfluechtige Verunreinigungen in der Probe vertreten sind, die die Ergebnisse beeinträchtigen könnten, kann der Stoff gereinigt werden.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Als Standardsiedetemperatur wird diejenige Temperatur definiert, bei der der Dampfdruck einer Flüssigkeit 101,325 kPa beträgt.

Wenn die Siedetemperatur nicht bei normalem Atmosphärendruck gemessen wird, kann die Temperaturabhängigkeit des Dampfdrucks durch die Clausius-Clapeyron-Gleichung beschrieben werden:

log p = 2,3 RTD Hv + const.

Darin bedeuten:

p = Dampfdruck des Stoffes in Pascal

Ä Hv = Verdampfungswärme in J mol 1

R = universelle molare Gaskonstante = 8,314 J mol 1 K 1

T = thermodynamische Temperatur in K

Die Siedetemperatur wird entsprechend dem Umgebungsdruck bei der Messung eingesetzt.

Umrechnungen

Druck (Einheiten: kPa)

100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa

("bar" ist weiterhin zulässig, wird aber nicht empfohlen);

133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr

(Die Einheiten "mm Hg" und "Torr" sind nicht zugelassen.).

1 atm = Standard-Atmosphäre = 101 325 Pa

(Die Einheit "atm" ist nicht zugelassen.)

Temperatur (Einheiten: K)

t = T 273,15

t: Celsius-Temperatur, in Grad Celsius ( C)

T: Thermodynamische Temperatur, Kelvin (K)

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Referenzsubstanzen müssen nicht in allen Fällen verwendet werden, in denen eine neue Prüfsubstanz untersucht wird. Die Referenzsubstanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.

Einige der Eichsubstanzen sind in den in der Anlage aufgeführten Methoden zu finden.

1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE

Fünf Methoden zur Bestimmung der Siedetemperatur (Siedebereich) beruhen auf der Messung der Siedetemperatur, zwei weitere auf der Thermoanalyse.

1.4.1. Bestimmung mit dem Ebulliometer

Ebulliometer wurden ursprünglich zur Bestimmung des Molekulargewichtes durch Erhöhung der Siedetemperatur entwickelt, eignen sich aber auch für genaue Messungen der Siedetemperatur. In ASTM D 1120-72 wird ein sehr einfaches Gerät beschrieben (siehe Anlage). Die Flüssigkeit wird in diesem Gerät unter Gleichgewichtsbedingungen bei atmosphärischem Druck erhitzt, bis sie siedet.

1.4.2. Dynamische Methode

Messung der Rekondensationstemperatur des Dampfes mit Hilfe eines geeigneten Thermometers im Rückfluß während des Siedeprozesses. Bei dieser Methode kann der Druck geändert werden.

1.4.3. Destillationsmethode für die Siedetemperatur

Destillation der Flüssigkeit und Messung der Rekondensationstemperatur des Dampfes sowie Bestimmung der Destillatmenge.

1.4.4. Verfahren nach Siwoloboff

Erhitzung einer Probe in einem Probenröhrchen, das in ein Wärmebad eingetaucht wird. Ein zugeschmolzenes Kapillarröhrchen, in dessen unterem Teil ein Luftbläschen enthalten ist, wird in das Probenröhrchen getaucht.

1.4.5. Photozellen-Detektion

Entsprechend dem Prinzip nach Siwoloboff wird unter Verwendung der aufsteigenden Bläschen eine automatische photölektrische Messung durchgeführt.

1.4.6. Differentialthermoanalyse

Mit diesem Verfahren wird der Temperaturunterschied zwischen der Substanz und einem Referenzmaterial in Abhängigkeit von der Temperatur aufgezeichnet, während die Substanz und das Referenzmaterial demselben kontrollierten Temperaturprogramm ausgesetzt werden. Wenn die Probe eine Phasenumwandlung mit Änderung der Enthalpie durchläuft, dann wird diese Änderung durch ein endothermes Abweichen (Sieden) von der Basis der Temperaturaufzeichnung angezeigt.

1.4.7. Differentialscanningkalorimetrie

Mit diesem Verfahren wird der Unterschied in der Energieaufnahme zwischen einer Substanz und einem Referenzmaterial in Abhängigkeit von der Temperatur aufgezeichnet, während die Substanz und das Referenzmaterial demselben kontrollierten Temperaturprogramm ausgesetzt werden. Bei der Energie handelt es sich um diejenige Energie, die notwendig ist, um einen Temperaturabgleich zwischen der Substanz und dem Referenzmaterial zu erreichen. Wenn die Probe eine Phasenumwandlung mit Änderung der Enthalpie durchläuft, dann wird diese Änderung durch ein endothermes Abweichen (Sieden) von der Basis des Wärmeflußbildes angezeigt.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Der Anwendungsbereich und die Genauigkeit der Methoden zur Bestimmung von Siedetemperatur/Siedebereich sind der Tabelle 1 zu entnehmen:

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODEN

Die Durchführung einiger der hier aufgeführten Prüfmethoden ist in nationalen und internationalen Normen beschrieben (siehe Anlage).

1.6.1. Ebulliometer

siehe Anlage.

1.6.2. Dynamische Methode

Siehe Prüfmethode A.4 für die Bestimmung des Dampfdrucks. Die bei einem Druck von 101,325 kPa beobachtete Siedetemperatur wird notiert.

1.6.3. Destillationsverfahren (Siedebereich)

siehe Anlage.

1.6.4. Verfahren nach Siwoloboff

Die Probe wird in einem Probenröhrchen - Durchmesser etwa 5 mm - in einer Apparatur zur Bestimmung der Schmelztemperatur erhitzt (Abbildung 1).

Abbildung 1 zeigt einen Typ einer genormten Apparatur zur Bestimmung der Schmelz- und Siedetemperatur (JIS K 0064); (Glas, alle Dimensionsangaben in mm).

Abbildung 1

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

A: Meßkolben

B: Stopfen

C: Druckausgleich

D: Thermometer

E: Hilfsthermometer

F: Badfluessigkeit

G: Probenröhrchen, Aussendurchmesser max. 5 mm, mit einem ca. 100 mm langen Kapillarröhrchen mit einem Innendurchmesser von ca. 1 mm und einer Wandstärke von ca. 0,2 bis 0,3 mm

H: seitlicher Stutzen

Ein etwa 1 cm über dem unteren Ende zugeschmolzenes Kapillarröhrchen (Siedekapillare) wird in das Probenröhrchen gegeben. Der Pegel, bis zu dem die Prüfsubstanz aufgefuellt wird, ist so zu wählen, daß der zugeschmolzene Abschnitt der Kapillare unter der Flüssigkeitsoberfläche liegt. Das die Siedekapillare enthaltende Probenröhrchen wird entweder mit einem Gummiband am Thermometer oder an einer seitlichen Halterung befestigt (siehe Abbildung 2).

Abbildung 2

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Prinzip nach Siwoloboff

Abbildung 3

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

modifiziertes Prinzip

Die Badfluessigkeit wird entsprechendder Siedetemperatur ausgewählt. Bei Temperaturen bis zu 573 K kann Silikonöl verwendet werden. Paraffinöl darf nur bis 473 K verwendet werden. Die Erhitzung der Badfluessigkeit sollte zunächst mit einer Temperaturrate von 3 K/min erfolgen. Die Badfluessigkeit muß gerührt werden. Ca. 10 K unterhalb der erwarteten Siedetemperatur wird die Erhitzung verlangsamt, so daß die Temperaturerhöhung bei weniger als 1 K/min liegt. Beim Erreichen der Siedetemperatur beginnen Bläschen schnell aus der Siedekapillare aufzusteigen.

Als Siedetemperatur ist diejenige anzugeben, bei welcher die Bläschenkette unter Kühlung abbricht und die Flüssigkeit plötzlich in der Kapillare aufzusteigen beginnt. Der entsprechende Thermometerstand ist gleich der Siedetemperatur der Substanz.

Beim modifizierten Prinzip (Abbildung 3) wird die Siedetemperatur in einem Schmelztemperaturröhrchen bestimmt. Es ist bis auf eine etwa 2 cm lange feine Spitze ausgezogen (a): eine geringe Menge der Probe wird angesaugt. Das offene Ende des freien Röhrchens wird zugeschmolzen, so daß sich am Ende ein feines Luftbläschen befindet. Bei der Erhitzung in der Apparatur zur Bestimmung der Schmelztemperatur (b) dehnt sich das Luftbläschen aus. Die Siedetemperatur entspricht der Temperatur, bei der der Pfropfen der Substanz den Oberflächenpegel der Badfluessigkeit erreicht (c).

1.6.5. Photozellen-Detektion

Die Probe wird in einem Kapillarröhrchen in einem Metallblock erhitzt.

Durch entsprechende Öffnungen im Block wird ein Lichtstrahl durch die Substanz auf eine genau kalibrierte Photozelle ausgerichtet.

Bei der Erhöhung der Temperatur der Probe steigen einzelne Luftbläschen aus der Siedekapillare auf. Wenn die Siedetemperatur erreicht ist, nimmt die Zahl der Bläschen stark zu. Dies führt zu einer von einer Photozelle aufgezeichneten Änderung in der Lichtintensität und löst ein Signal im Meßgerät aus, das die Temperatur eines im Block gelegenen Platin-Widerstandsthermometers anzeigt.

Dieses Verfahren ist besonders nützlich, da es Bestimmungen unterhalb der Raumtemperatur bis zu 253,15 K ( 20 C) ohne jede apparative Änderung ermöglicht. Das Instrument muß lediglich in ein Kühlbad gestellt werden.

1.6.6. Thermoanalyse

1.6.6.1. Differentialthermoanalyse

siehe Anlage.

1.6.6.2. Differentialscanningkalorimeter

siehe Anlage.

2. DATEN

Bei geringfügigen Abweichungen vom Normaldruck (maximal 5 kPa) werden die Siedetemperaturen mit Hilfe der nachstehenden Sidney-Young-Zahlen-Wert-Gleichung auf Tn umgerechnet:

log p = 2,3 RTD Hv + C

Darin bedeuten:

Äp = (101,325 p) [Vorzeichen beachten]

p = Barometermessung in kPa

fT = Korrekturfaktor für die Änderung der Siedetemperatur in Abhängigkeit vom Druck in K/kPa

T = gemessene Siedetemperatur in K

Tn = Siedetemperatur, berichtigt auf Normaldruck in K

Die Temperatur-Korrekturfaktoren fT und die Gleichungen für ihre Näherung sind für zahlreiche Stoffe in den erwähnten internationalen und nationalen Normen (Anlage) aufgeführt.

So gibt beispielsweise die Vorschrift nach DIN 53171 die folgenden ungefähren Korrekturen für Lösungsmittel in Anstrichstoffen:

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

3. ABSCHLUSSBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- verwendetes Verfahren;

- genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen), ggf. Vorreinigung;

- eine ungefähre Angabe zur Genauigkeit.

Der Mittelwert mindestens zweier Messungen, deren Werte im Bereich der ungefähren Genauigkeit (siehe Tabelle 1) liegen, ist als Siedetemperatur anzugeben.

Die gemessenen Siedetemperaturen und ihr Mittelwert sowie der Druck (die Drücke) in kPa, bei dem (bei denen) die Messungen durchgeführt wurden, sind anzugeben. Der Druck sollte möglichst nahe beim Normaldruck liegen.

Alle zur Bewertung der Ergebnisse notwendigen Informationen und Bemerkungen sind zu notieren, insbesondere diejenigen über Verunreinigungen und den Aggregatzustand des Stoffes.

4. LITERATUR

(1) ÖCD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar (Hrsg.): Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II.

(3) R. Weißberger (Hrsg.): Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.

Anlage

Zu weiteren technischen Einzelheiten können beispielsweise folgende Normen herangezogen werden:

1. Ebulliometer

ASTM D 1120-72 Standard test method für boiling point of engine anti-freezes

2. Destillationsverfahren (Siedebereich)

ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)

BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products

BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics

DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufs

NF T 20-608 Distillation: dtermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Differentialthermoanalyse und Differentialscanningkalorimetrie

ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe

A.3. RELATIVE DICHTE

1. METHODE

Den hier beschriebenen Methoden liegt die ÖCD-Prüfrichtlinie (1) zugrunde. Die Grundprinzipien sind in (2) angegeben.

1.1. EINLEITUNG

Die hier beschriebenen Methoden zur Bestimmung der relativen Dichte gelten für Feststoffe und Flüssigkeiten ohne jede Einschränkung in bezug auf ihren Reinheitsgrad. Die verschiedenen zu verwendenden Methoden sind in Tabelle 1 aufgeführt.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Die relative Dichte, D420, von Feststoffen oder Flüssigkeiten ist das Verhältnis zwischen der Masse eines bestimmten Volumens der Prüfsubstanz, gemessen bei 20 C, und der Masse des gleichen Volumens Wasser, bestimmt bei 4 C. Die relative Dichte hat keine Einheit.

Die Dichte, , eines Stoffes ist gleich dem Quotienten aus seiner Masse m und seinem Volumen v.

Die Dichte, , wird in SI-Einheiten (kg/m3) angegeben.

1.3. REFERENZSUBSTANZEN (1) (3)

Bei der Messung der relativen Dichte von Prüfsubstanzen brauchen im allgemeinen Referenzsubstanzen nicht verwendet zu werden. Die Referenzsubstanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.

1.4. PRINZIP DER METHODEN

Es werden vier Messprinzipien verwendet.

1.4.1. Auftriebsmethoden

1.4.1.1. Araeometer (für Flüssigkeiten)

Hinreichend genaue und schnelle Bestimmungen der Dichte können mit Araeometern erreicht werden, bei denen die Dichte einer Flüssigkeit durch Ablesen der Eintauchtiefe des Schwimmkörpers an einer graduierten Skala ermittelt werden kann.

1.4.1.2. Hydrostatische Waage (für Flüssigkeiten und Feststoffe)

Der Unterschied zwischen dem Gewicht eines in Luft und in einer geeigneten Flüssigkeit (z.B. Wasser) gemessenen Prüfkörpers kann zur Bestimmung seiner Dichte verwendet werden.

Bei Feststoffen ist die gemessene Dichte nur für die verwendete Probe repräsentativ. Zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten wird ein Körper eines bekannten Volumens v zunächst in der Luft und dann in der Flüssigkeit gewogen.

1.4.1.3. Tauchkörpermethode (für Flüssigkeiten) (4)

Bei dieser Methode wird die Dichte einer Flüssigkeit aus der Differenz zwischen den Ergebnissen der Wägung des Tauchkörpers bekannten Volumens vor und nach dem Eintauchen dieses Körpers in die Prüffluessigkeit ermittelt.

1.4.2. Pyknometer-Methoden

Für Feststoffe oder Flüssigkeiten können Pyknometer verschiedener Formen mit bekannten Volumina verwendet werden. Die Dichte wird aus der Differenz zwischen der Wägung des vollen und des leeren Pyknometers und seinem bekannten Volumen errechnet.

1.4.3. Luftvergleichspyknometer (für Feststoffe)

Die Dichte eines Feststoffes beliebiger Form kann bei Raumtemperatur mit dem Gasvergleichspyknometer gemessen werden. Das Volumen einer Substanz wird in der Luft oder in einem Inertgas in einem Zylinder mit veränderbarem kalibrierten Volumen gemessen. Zur Berechnung der Dichte wird nach Abschluß der Volumenmessung eine Wägung durchgeführt.

1.4.4. Schwingungsdichtemesser (5) (6) (7)

Die Dichte einer Flüssigkeit kann mit einem Schwingungsdichtemesser gemessen werden. Ein in Form eines U-Rohres gebauter mechanischer Oszillator wird in Schwingungen versetzt; die Resonanzfrequenz des Oszillators hängt von dessen Masse ab. Bei Einführung einer Probe in das U-Rohr ändert sich die Resonanzfrequenz des Oszillators. Das Gerät muß mit Hilfe von zwei Flüssigkeiten bekannter Dichte kalibriert werden. Diese Flüssigkeiten sollten möglichst so gewählt werden, daß ihre Dichte den zu messenden Bereich einschließt.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Der Anwendungsbereich der verschiedenen zur Bestimmung der relativen Dichte verwendeten Methoden ist der Tabelle zu entnehmen.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODEN

Die als Beispiel aufgeführten Normen, die im Hinblick auf weitere technische Einzelheiten herangezogen werden müssen, sind als Anlage beigefügt.

Die Prüfungen sind bei 20 C durchzuführen, wobei mindestens zwei Messungen vorzunehmen sind.

2. DATEN

siehe Normen.

3. ABSCHLUSSBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- verwendetes Verfahren;

- genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen), ggf. Vorreinigung.

Die relative Dichte, D420, soll gemäß 1.2 zusammen mit dem Aggregatzustand des gemessenen Stoffes angegeben werden.

Alle zur Bewertung der Ergebnisse notwendigen Informationen und Bemerkungen sind zu notieren, insbesondere diejenigen über Verunreinigungen des Stoffes.

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

4. LITERATUR

(1) ÖCD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) R. Weißberger (Hrsg.), Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.

(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.

(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427-430.

(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302.

(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen - Verfahren zur Dichtebestimmung bei fluessigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.

(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.

Anlage

Für weitere technische Einzelheiten können beispielsweise folgende Normen herangezogen werden:

1. AUFTRIEBSMETHODEN

1.1. Araeometer

DIN 12790, ISO 387 Araeometer; allgemeine Bestimmungen

DIN 12791 Teil 1: Dichte-Araeometer; Grundserien, Ausführung, Justierung und Anwendung

Teil 2: Dichte-Araeometer; Normgrössen, Bezeichnungen

Teil 3: Anwendung und Prüfung

ISO 649-2 Laboratory glaßware: Density hydrometers for general purpose

NF T 20-050 Chemical products for industrial use - Determination of density of liquids - Areometric method

DIN 12793 Laborgeräte aus Glas: Sucharäometer für Vormessung und rohe Betriebsmessung

1.2. Hydrostatische Waage

Für Feststoffe:

ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

NF T 20-049 Chemical products for industrial use - Determination of the density of solids other than powders and cellular products - Hydrostatic balance method

ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement

DIN 53479 Prüfung von Kunststoffen und Elastomeren; Bestimmung der Dichte

Für Flüssigkeiten:

ISO 901 ISO 758

DIN 51757 Prüfung von Mineralölen und verwandten Stoffen; Bestimmung der Dichte

ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 und ASTM D 1481-62

ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3. Tauchkörpermethode

DIN 53217 Prüfung von Anstrichstoffen; Bestimmung der Dichte; Tauchkörpermethode

2. PYKNOMETER-METHODEN

2.1. Für Flüssigkeiten

ISO 3507 Pycnometers

ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 C

DIN 12797 Pyknometer nach Gay-Lussac (für nicht besonders viskose, nicht fluechtige Flüssigkeiten)

DIN 12798 Pyknometer nach Lipkin (für Flüssigkeiten mit einer kinematischen Viskosität von weniger als 100,10 6 m2 s 1 bei 15 C)

DIN 12800 Pyknometer nach Sprengel (für Flüssigkeiten wie in DIN 12798)

DIN 12801 Pyknometer nach Reischauer (für Flüssigkeiten mit einer kinematischen Viskosität von weniger als 100,10 6 m2 s 1 bei 20 C; kann insbesondere auf Kohlenwasserstoffe sowie auf Flüssigkeiten mit hohem Dampfdruck - etwa 1 bar bei 90 C - angewendet werden)

DIN 12806 Pyknometer nach Hubbard (für viskose Flüssigkeiten aller Arten, die keinen zu hohen Dampfdruck aufweisen, insbesondere auch für Anstrichstoffe und Bitumen)

DIN 12807 Pyknometer nach Bingham (für Flüssigkeiten wie in DIN 12801)

DIN 12808 Pyknometer nach Jaulmes (insbesondere für Ethanol-Wasser-Gemisch)

DIN 12809 Pyknometer mit eingeschliffenem Thermometer und Seitenkapillaren (für nicht besonders viskose Flüssigkeiten)

DIN 53217 Prüfung von Anstrichstoffen; Bestimmung der Dichte mit dem Pyknometer

DIN 51757 Punkt 7: Prüfung von Mineralölen und verwandten Stoffen; Bestimmung der Dichte

ASTM D 297 (Section 15: Rubber products - chemical analysis)

ASTM D 2111 (Method C: Halogenated organic compounds)

BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)

BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method

NF T 20-053 Chemical products for industrial use - Determination of density of solids in powder and liquids - Pycnometric method

2.2. Für Feststoffe

ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics.

NF T 20-053 Chemical products for industrial use - Determination of density of solids in powder and liquids - Pycnometric method

DIN 19683 Bestimmung der Dichte von Böden

3. LUFTVERGLEICHSPYKNOMETER

DIN 55990 Teil 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte

DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

A.4. DAMPFDRUCK

1. METHODEN

Den meisten der hier beschriebenen Methoden liegt die ÖCD-Prüfrichtlinie (1) zugrunde. Die Grundprinzipien sind in (2) und (3) angegeben.

1.1. EINLEITUNG

Zur Durchführung der Prüfung ist es nützlich, Vorinformationen über die Struktur, die Schmelz- und die Siedetemperatur der Prüfsubstanz zu haben.

Es gibt keine Prüfmethode, die für den gesamten Dampfdruck-Meßbereich geeignet ist. Daher werden zur Messung der Dampfdrücke von PLATZ FÜR EINE TABELLE>

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODEN

1.6.1. Dynamische Method

1.6.1.1. Apparatur

Die Apparatur besteht im allgemeinen aus einem Siedegefäß mit Aufsatzkühler aus Glas oder Metall (Abbildung 1) sowie einer entsprechenden Einrichtung zum Messen der Temperatur sowie zum Regeln und Messen des Drucks. Die in der Abbildung dargestellte typische Apparatur besteht aus hitzebeständigem Glas und setzt sich aus fünf Teilen zusammen:

Grosses, teilweise doppelwandiges Rohr, bestehend aus einer Schliffverbindung, einem Kühler, einem Kühlkolben und einem Einlaß.

Glaszylinder mit Cottrellpumpe, der im Siedebereich des Rohres angebracht ist und innen eine aufgerauhte Oberfläche aus gesintertem Glas besitzt, um Siedeverzuege zu vermeiden.

Die Temperatur wird mit einem geeigneten Temperaturfühler (z.B. Widerstandsthermometer, Mantelthermölement) gemessen, der durch einen geeigneten Einlaß (z.B. Kernschliffverbindung) in die Apparatur eingetaucht wird und bis an die Meßstelle (Nr. 5, Abbildung 1) reicht.

Die notwendigen Verbindungen zur Druckregel- und Messeinrichtung werden hergestellt.

Der Rundkolben, der als Puffervolumen dient, wird mittels einer Kapillare mit der Messapparatur verbunden.

Das Siedegefäß wird durch ein Heizelement (z.B. Heizpatrone) erhitzt, welches von unten in die Glasapparatur eingeführt wird. Der erforderliche Heizstrom wird mit einem Thermölement eingestellt und geregelt.

Das erforderliche Vakuum zwischen 102 Pa und etwa 105 Pa wird mit einer Vakuumpumpe erzeugt.Ein geeignetes Ventil wird zur Dosierung von Luft oder Stickstoff zwecks Druckregelung (Meßbereich etwa 102 Pa bis 105 Pa) und Belüftung verwendet.

Zur Druckmessung dient ein Manometer.

1.6.1.2. Meßvorgang

Zur Bestimmung des Dampfdrucks der Probe misst man deren Siedetemperatur bei verschiedenen festgelegten Drücken zwischen ungefähr 103 und 105 Pa. Die Siedetemperatur ist erreicht, wenn die Temperatur bei konstantem Druck einen zeitlich konstanten Wert erreicht hat. Diese Methode eignet sich nicht zur Messung der Dampfdrücke schäumender Substanzen.

Die Prüfsubstanz wird in das gereinigte und getrocknete Probengefäß gegeben. Dabei kann es bei nicht pulverförmigen Feststoffen Probleme geben, doch lassen sich diese mitunter durch Erwärmen des Kühlmantels umgehen. Nach dem Einfuellen wird die Apparatur zugeflanscht und die Substanz entgast. Danach stellt man den niedrigsten gewünschten Druck ein und schaltet die Heizung an. Gleichzeitig schließt man den Temperaturfühler an einen Schreiber an.

Das Gleichgewicht ist dann erreicht, wenn bei konstantem Druck eine konstante Siedetemperatur erreicht wird. Besondere Vorkehrungen sind zu treffen, um Siedeverzuege zu vermeiden. Darüber hinaus muß es am Kühler zu einer vollständigen Kondensation kommen. Bei der Bestimmung des Dampfdrucks von niedrigschmelzenden Feststoffen sind Vorkehrungen zu treffen, um eine Blockierung des Kühlers zu vermeiden.

Nach Registrierung des Gleichgewichtspunktes wird ein höherer Druck eingestellt. Dann fährt man auf diese Weise fort, bis ein Druck von 105 Pa erreicht ist (ungefähr 5 bis 10 Messungen insgesamt). Zur Überprüfung müssen die Gleichgewichtsbestimmungen bei abnehmendem Druck wiederholt werden.

1.6.2. Statische Methode

1.6.2.1. Apparatur

Die Apparatur umfasst ein Behältnis für die Probe sowie ein Heiz- und Kühlsystem zur Temperierung der Probe sowie eine Vorrichtung zur Messung der Temperatur. Ausserdem enthält die Apparatur Instrumente zur Einstellung und Messung des Drucks. Die in Anwendung kommenden Grundprinzipien sind in den Abbildungen 2a und 2b dargestellt.

Der Probenraum (Abbildung 2a) wird auf der einen Seite durch ein geeignetes Hochvakuumventil begrenzt. Auf der anderen Seite ist ein U-Rohr angebracht, das eine geeignete Manometerfluessigkeit enthält. Ein Abzweig des U-Rohres führt zur Vakuumpumpe, zum Stickstoffzylinder oder Belüftungsventil und zu einem Manometer.

Anstelle eines U-Rohres kann ein Manometer mit einer Manometerfluessigkeit (Abbildung 2b) verwendet werden.

Zur Temperierung der Probe bringt man den Probenbehälter zusammen mit dem Ventil und dem U-Rohr oder Druckmesser in ein Bad, das konstant auf 0,2 K zu temperieren ist. Die Temperaturmessungen werden an der Aussenwand des Probengefässes oder im Gefäß selbst vorgenommen.

Die Apparatur wird mit einer Vakuumpumpe mit einer vorgeschalteten Kühlfalle evakuiert.

Bei Methode 2a misst man den Dampfdruck der Substanz indirekt über eine Nullanzeige. Dabei wird berücksichtigt, daß sich die Dichte der Flüssigkeit im U-Rohr durch grössere Temperaturschwankungen ändert.

Zur Verwendung als Manometerfluessigkeit lassen sich je nach Druckbereich und chemischem Verhalten der Prüfsubstanz folgende Flüssigkeiten verwenden: Silikonöle, Phthalate. Die Prüfsubstanz darf sich in der Manometerfluessigkeit nicht merklich lösen, noch mit ihr reagieren.

Als Manometerfluessigkeit lässt sich Quecksilber im Bereich von normalem Luftdruck bis 102 Pa, Silikonöle und Phthalate lassen sich auch unter 102 Pa bis hinab zu 10 Pa verwenden. Heizbare Membrankapazitätsmanometer lassen sich sogar unter 10 1 Pa einsetzen. Daneben gibt es noch andere Manometer, die unter 102 Pa verwendet werden können.

1.6.2.2. Meßvorgang

Vor der Messung müssen alle Bestandteile der Apparatur von Abbildung 2 gründlich gereinigt und getrocknet werden.

Bei der Methode 2a wird das U-Rohr mit der gewählten Flüssigkeit gefuellt, die bei erhöhter Temperatur entgast werden muß, bevor die Ablesungen vorgenommen werden.

Die Prüfsubstanz wird in die Apparatur gegeben, die dann verschlossen und auf eine zum Entgasen hinreichend tiefe Temperatur gebracht wird. Die Temperatur muß deshalb niedrig genug sein, um sicherzustellen, daß die Luft tatsächlich abgesaugt wird; dennoch darf - bei einem Mehrkomponentensystem - die Zusammensetzung des Stoffes nicht verändert werden. Soweit erforderlich, kann das Gleichgewicht schneller durch Rühren hergestellt werden.

Die Unterkühlung der Probe kann z.B. mit fluessigem Stickstoff (Achtung: Kondensation der Luft, Pumpenfluessigkeit) oder einer Mischung aus Ethanol und Trockeneis vorgenommen werden. Bei Niedrigtemperatur-Messungen kann ein an einen Ultrakryostaten angeschlossenes temperiertes Bad verwendet werden.

Bei geöffnetem Ventil über dem Probenbehälter wird mehrere Minuten lang die Luft abgesaugt. Danach wird das Ventil geschlossen und die Probe auf die niedrigste gewünschte Temperatur abgekühlt. Falls notwendig, ist der Entgasungsvorgang mehrere Male zu wiederholen.

Bei Erhitzung der Probe nimmt der Dampfdruck zu. Dadurch werden die beiden Niveaus der Flüssigkeit im U-Rohr verändert. Zum Ausgleich wird Stickstoff oder Luft über ein Ventil in die Apparatur geleitet, bis die Niveaus der Manometerfluessigkeit erneut den Gleichstand erreicht haben. Der dafür erforderliche Druck lässt sich mit einem Präzisionsmanometer bei Raumtemperatur ablesen. Dieser

Druck entspricht dem Dampfdruck der Substanz bei dieser Messtemperatur.

Methode 2b ähnelt dem hier beschriebenen Verfahren, doch wird der Dampfdruck direkt abgelesen.

Die Temperaturabhängigkeit des Dampfdrucks wird in genügend kleinen Intervallen (insgesamt 5 bis 10 Messpunkte) bis zum gewünschten Maximum bestimmt. Bei niedrigen Temperaturen vorgenommene Ablesungen sind zwecks Überprüfung zu wiederholen.

Wenn die aus den wiederholten Ablesungen stammenden Werte nicht mit der bei steigender Temperatur erhaltenen Kurve übereinstimmen, kann dies eine der nachstehend genannten Ursachen haben:

1. Die Probe enthält noch Luft (z.B. besonders bei viskosen Stoffen) oder niedrigsiedende Substanzen, die im Verlauf des Aufheizens freigesetzt wird/werden und nach erneuter Unterkühlung abgesaugt werden kann/können.

2. Die Kühltemperatur ist nicht niedrig genug. In diesem Fall wird fluessiger Stickstoff als Kühlmittel eingesetzt.

Sowohl bei 1 als auch bei 2 sind die Messungen zu wiederholen.

3. Der Stoff durchläuft im untersuchten Temperaturbereich eine chemische Reaktion (z.B. Zersetzung, Polymerisierung).

1.6.3. Isoteniskop

Für eine vollständige Beschreibung dieser Methode wird auf (7) verwiesen. Das Prinzip des Meßgeräts zeigt Abbildung 3. Ebenso wie die in 1.6.2. beschriebene statische Methode eignet sich das Isoteniskop zur Untersuchung von Feststoffen und Flüssigkeiten.

Bei der Untersuchung von Flüssigkeiten verwendet man diese gleichzeitig als Anzeigesäule im Hilfsmanometer. Eine Flüssigkeitsmenge, ausreichend, um den Boden und den kurzen Schenkel des Manometers zu fuellen, wird in das Isoteniskop gefuellt. Danach wird dieses an ein Vakuumsystem angeschlossen, evakuiert und schließlich mit Stickstoff gefuellt. Evakuierung und Reinigung des Systems werden zweimal wiederholt, um den restlichen Sauerstoff zu entfernen. Das gefuellte Isoteniskop wird in eine horizontale Lage gebracht, so daß sich die Prüfsubstanz als dünne Schicht im Bodenteil und im Manometer (U-Rohr) verteilt. Danach wird der Druck des Systems auf 133 Pa reduziert und die Probe vorsichtig erwärmt, bis sie eben zu sieden anfängt (Entfernung aufgelöster Gase). Anschließend wird das Isoteniskop in eine solche Lage gebracht, daß die Probe in den unteren Teil des U-Rohres und den kurzen Schenkel des Manometers zurückfließt, so daß beide vollständig mit Flüssigkeit gefuellt sind. Der Druck wird wie beim Entgasen konstant gehalten und die ausgezogene Plättchen unter kleiner Flamme erhitzt, bis sich der Dampf der Prüfsubstanz ausreichend ausdehnt, um einen Teil der Substanz aus dem oberen Teil des U-Rohres und dem Manometerschenkel in den Manometer-Teil des Isoteniskops zu verdrängen und einen mit Dampf gefuellten stickstoffreien Raum zu schaffen.

Danach wird das Isoteniskop in ein Bad mit konstanter Temperatur gegeben und der Druck des Stickstoffs an den Druck der Prüfsubstanz angeglichen. Der Gleichstand beider Drücke wird vom Manometer-Teil des Isoteniskops angezeigt. Im abgeglichenen Zustand sind der Dampfdruck des Stickstoffs und der Dampfdruck der Prüfsubstanz gleich.

Bei der Untersuchung von Feststoffen werden je nach Druck- und Temperaturbereich die in 1.6.2.1 aufgeführten Manometerfluessigkeiten benutzt. Die entgaste Manometerfluessigkeit wird in eine Ausbuchtung am langen Schenkel des Isotensikops gefuellt. Dann wird der zu prüfende Feststoff in das Bodenteil eingebracht und bei erhöhter Temperatur entgast. Danach wird das Isoteniskop geneigt, damit die Manometerfluessigkeit in das U-Rohr fließen kann. Zur Messung des Dampfdrucks in Abhängigkeit von der Temperatur verfährt man wie in 1.6.2. angegeben.

1.6.4. Effusionsmethode: Dampfdruckwaage

1.6.4.1. Apparatur

In der Literatur werden verschiedene Ausführungen der Apparatur beschrieben (1). Die hier beschriebene Apparatur dient zur Darstellung des allgemeinen Funktionsprinzips (Abbildung 4). In Abbildung 4 sind die Hauptbestandteile des Gerätes wiedergegeben: ein Hochvakuum-Behälter aus Edelstahl oder Glas, Ausrüstungen zur Erzeugung und Messung eines Vakuums sowie eingebaute Bauteile zur Messung des Dampfdrucks auf einer Waage. Die Apparatur schließt folgende Einbauten ein:

- Ein Verdampferofen mit Flansch und Dreheinlaß. Bei dem Verdampferofen handelt es sich um ein zylindrisches Gefäß, z.B. aus Kupfer oder einer chemisch resistenten Legierung mit guter Wärmeleitfähigkeit. Ebenso kann ein Glasgefäß mit einer Kupferummantelung verwendet werden. Der Ofen hat einen Durchmesser von etwa 3 bis 5 cm und eine Höhe von 2 bis 5 cm. Für den Dampfstrom sind zwischen einer und drei Öffnungen unterschiedlicher Grösse vorhanden. Der Ofen wird entweder durch eine darunter angeordnete Heizplatte oder eine um die Aussenwand geführte Heizspirale erhitzt. Um eine Wärmeableitung an die Grundplatte zu verhindern, wird der Heizkörper über ein Metall mit einer niedrigen Wärmeleitfähigkeit (Nickel-Silber- oder Chrom-Nickel-Stahl) mit der Grundplatte verbunden, z.B. bei Verwendung eines Ofens mit mehreren Öffnungen über ein Nickel-Silber-Rohr, das mit einem Dreheinlaß verbunden ist. Diese Anordnung bietet den Vorteil, daß ein Kupferstab eingeschoben werden kann, wodurch die Kühlung von aussen mit Hilfe eines Kühlbades möglich ist.

- Wenn der Ofendeckel aus Kupfer mit drei Öffnungen unterschiedlichen Durchmessers versehen ist, die um 90 gegeneinander versetzt sind, lassen sich mehrere Dampfdrücke innerhalb des Gesamtmeßbereichs erfassen (Öffnungen mit einem Durchmesser zwischen etwa 0,30 und 4,50 mm). Dabei werden die grossen Öffnungen für einen niedrigen Dampfdruck verwendet und umgekehrt. Durch Drehen des Ofens lässt sich die gewünschte Öffnung oder eine Zwischenstellung im Dampfstrom (Ofenöffnung - Blende - Waagschale) einstellen, wodurch der Molekularstrahl durch die Ofenöffnung auf die Waagschale freigegeben oder abgeblendet werden kann. Zur Messung der Temperatur der Prüfsubstanz ist an geeigneter Stelle ein Thermölement oder ein Widerstandthermometer angebracht.

- Über der Blende befindet sich eine Waagschale, die zu einer hochempfindlichen Mikrowaage gehört (siehe unten). Die Waagschale hat einen Durchmesser von etwa 30 mm. Ein geeignetes Material dafür ist vergoldetes Aluminium.

- Die Waagschale ist von einem zylindrischen Kühlbehälter aus Messing oder Kupfer ummantelt. Dieser ist je nach Art der Waage mit Öffnungen für den Waagebalken und mit einer Öffnung für den Eintritt des Molekularstrahls versehen und sorgt für die vollständige Kondensation des Dampfes auf der Waagschale. Zur Wärmeableitung nach aussen dient z.B. ein mit dem Kühlbehälter verbundener Kupferstab, der z.B. mit einem Rohr aus Chrom-Nickel-Stahl wärmeisoliert durch die Grundplatte geführt ist. Der Kupferstab taucht in ein mit fluessigem Stickstoff gefuelltes Dewargefäß unter der Grundplatte ein oder wird von fluessigem Stickstoff durchflutet. Dadurch wird der Kühlbehälter auf einer Temperatur von etwa 120 C gehalten. Die Waagschale wird ausschließlich durch Strahlung gekühlt; sie reicht für den hier zu prüfenden Druckbereich aus (Kühlung etwa 1 Stunde vor Beginn der Messung).

- Die Waage wird oberhalb des Kühlbehälters angebracht. Geeignete Waagen sind z.B. eine hochempfindliche zweiarmige elektronische Mikrowaage (8) oder ein hochempfindliches Drehspulinstrument (siehe ÖCD-Prüfrichtlinie 104, Ausgabe 12.5.81).

- Die Grundplatte hat auch elektrische Anschlüsse für Thermölemente (oder Widerstandsthermometer) sowie Heizspulen.

- Im Behälter wird mit Hilfe einer Vorvakuum- oder einer Hochvakuum-Pumpe ein Vakuum erzeugt (erforderliches Vakuum : etwa 1 bis 2710 3 Pa, erreicht nach 2stuendigem Pumpen). Der Druck wird mit einem geeigneten Ionisationsmanometer gemessen.

1.6.4.2. Meßvorgang

Man fuellt den Behälter mit der Prüfsubstanz und schließt ihn mit dem Deckel. Die Blende mit dem Kühlkasten wird über den Ofen geschoben. Dann wird die Apparatur geschlossen, und die Vakuumpumpen werden eingeschaltet. Vor Beginn der Messungen sollte der Enddruck ungefähr 10 4 Pa betragen. Ab 10 2 Pa beginnt man mit dem Kühlen des Kühlkastens.

Nach Erreichen des erforderlichen Vakuums beginnt man mit der Kalibrierungsreihe bei der niedrigsten gewünschten Temperatur. Man stellt die entsprechende Öffnung im Deckel ein; der Dampfstrahl passiert die direkt darüber befindliche Blende und trifft auf die gekühlte Waagschale. Die Waagschale muß groß genug sein, damit der gesamte durch die Blende geführte Strahl auf sie auftrifft. Der Impuls des Dampfstrahls übt eine Kraft auf die Waagschale aus, und die Moleküle kondensieren auf ihrer gekühlten Oberfläche.

Durch diesen Impuls und die gleichzeitige Kondensation wird ein Signal auf dem Registriergerät erzeugt. Die Auswertung der Signale ergibt zwei Informationen:

1. Bei der hier beschriebenen Apparatur wird der Dampfdruck direkt aus dem Impuls auf die Waagschale bestimmt (Die Kenntnis des Molekulargewichts ist dafür nicht erforderlich (2)). Bei der Auswertung der Ablesungen müssen geometrische Faktoren wie z.B. die Ofenöffnung und der Winkel des Molekularstromes berücksichtigt werden.

2. Gleichzeitig ist eine Messung der Kondensatmasse möglich, aus der die Verdampfungsgeschwindigkeit berechnet werden kann. Der Dampfdruck lässt sich nach der Hertz-Formel (2) auch aus der Verdampfungsgeschwindigkeit und dem Molekulargewicht berechnen.

p = G2 p RT 103M

Dabei bedeuten:

G = Verdampfungsgeschwindigkeit (kg s 1 m 2)

M = Molekulargewicht (g mol 1)

T = Temperatur (K)

R = universelle molare Gaskonstante (J mol 1 K 1)

p = Dampfdruck (Pa).

Nach Erreichen des erforderlichen Vakuums beginnt man die Meßreihe bei der niedrigsten gewünschten Temperatur.

Im weiteren Verlauf der Messung steigert man die Temperatur in kleinen Intervallen, bis der höchste gewünschte Temperaturwert erreicht ist. Anschließend wird die Probe wieder abgekühlt, und man kann gegebenenfalls eine zweite Dampfdruckkurve aufzeichnen. Falls der zweite Durchgang die Resultate des ersten nicht bestätigt, ist dies unter Umständen darauf zurückzuführen, daß sich die Substanz im untersuchten Temperaturbereich zersetzt.

1.6.5. Effusionsmethode - durch Masseverlust

1.6.5.1. Apparatur

Die verwendete Apparatur besteht aus den folgenden Hauptbestandteilen:

- temperier- und evakuierbarer Behälter, in dem die Effusionszellen untergebracht sind

- Hochvakuumpumpe (z.B. Diffusionspumpe oder Turbomolekularpumpe) mit Vakuummeßgerät

- Kühlfalle mit verfluessigtem Stickstoff oder Trockeneis.

In Abbildung 5 ist als Beispiel ein elektrisch beheizter Aluminiumbehälter mit 4 Effusionszellen aus Edelstahl dargestellt. Die Edelstahlblende (etwa 0,3 mm dick) hat eine Effusionsöffnung von 0,2 bis 1,0 mm Durchmesser und wird mit der Effusionszelle über einen Deckel mit Gewinde verbunden.

1.6.5.2. Meßvorgang

Referenz- und Prüfsubstanz werden in jede Effusionszelle gefuellt, die Metallblende mit Hilfe des Gewindedeckels gesichert und jede Zelle auf 0,1 mg genau gewogen. Danach wird die Zelle in die temperierte Apparatur gegeben, die schließlich bis auf weniger als ein Zehntel des erwarteten Drucks evakuiert wird. Dann wird die Apparatur in definierten Zeitabständen zwischen 5 und 30 Stunden belüftet und der Masseverlust der Effusionszelle durch erneutes Wiegen bestimmt.

Um sicherzustellen, daß die Ergebnisse nicht durch fluechtige Verunreinigungen beeinflusst werden, wird die Zelle in definierten Zeitabständen erneut gewogen. Dadurch soll geprüft werden, ob die Verdampfungsgeschwindigkeit mindestens über zwei Zeitabstände konstant bleibt.

Der Dampfdruck p in der Effusionszelle wird errechnet durch

p =m KAtE2pRTM

Dabei bedeuten

p = Dampfdruck (Pa)

m = Masse der Substanz, die im Verlauf der Zeit t aus der Zelle ausströmt (kg)

t = Zeit (s)

A = Fläche des Loches (m2)

K = Korrekturfaktor

R = universelle Gaskonstante (J mol 1 K 1)

T = Temperatur (K)

M = Molekulargewicht (kg mol 1)

Der Korrekturfaktor K hängt vom Verhältnis Länge/Radius der zylindrischen Öffnung ab:

Verhältnis:0,10,20,61,02,0

K:0,9520,9090,7710,6720,514

Die obige Gleichung kann dann wie folgt geschrieben werden:

p = EmtTM

Dabei ist

E =1KA2pR die Konstante der Effusionszelle.

Die Konstante E der Efusionszelle lässt sich mit Hilfe folgender Gleichung mittels Referenzsubstanzen bestimmen (2,9):

E =p(r)tmM(r)T

Dabei sind

p(r) = der Dampfdruck der Referenzsubstanz (Pa)

M(r) = das Molekulargewicht der Referenzsubstanz (kg mol 1).

1.6.6. Gassättigungsmethode

1.6.6.1. Apparatur

Eine für diesen Test verwendete typische Apparatur besteht aus einer Reihe von in Abbildung 6a dargestellten und nachstehend beschriebenen Bestandteilen (1).

Trägergas:

Das Trägergas darf mit der Prüfsubstanz nicht chemisch reagieren. Gewöhnlich ist Stickstoff als Trägergas geeignet,doch zuweilen kann die Verwendung anderer Gase erforderlich sein (10). Das verwendete Gas muß trocken sein (siehe Abbildung 6a, Ziffer 4: Sensor zur Messung der relativen Feuchtigkeit).

Durchflußkontrolle:

Ein geeignetes Regelsystem zur Kontrolle des Gasstromes ist notwendig, um einen konstanten und wahlweise einstellbaren Gasfluß durch die Sättigungssäule zu gewährleisten.

Kühlfallen zum Niederschlagen des Dampfes:

Ihre Wahl hängt von den jeweiligen Eigenschaften der Prüfsubstanz und der verwendeten Analysenmethode ab. Die Dämpfe sollten quantitativ so abgeschieden werden, daß eine anschließende Analyse möglich ist. Für manche Prüfsubstanzen werden sich mit Flüssigkeiten wie Hexan oder Ethylenglykol gefuellte Kühlfallen anbieten. Für andere wiederum mögen feste Adsorber zur Anwendung kommen.

Als Alternative zur Dampfabscheidung mit anschließender Analyse lassen sich on-line-Analysenmethoden wie z.B. die Chromatographie einsetzen, um die von einem bekannten Volumen an Trägergas mitgeführte Substanzmenge quantitativ zu bestimmen. Der Dampfdruck kann auch aus dem Masseverlust der eingesetzten Probe und bekanntem Trägergasvolumen bestimmt werden.

Wärmeaustauscher:

Zur Messung bei verschiedenen Temperaturen kann es notwendig sein, einen Wärmeaustauscher zur

Temperierung des Trägergases in die Anordnung mit einzubauen.

Sättigungssäule:

Die Prüfsubstanz wird aus einer Lösung auf ein geeignetes inertes Trägermaterial aufgebracht. Das so beschichtete Trägermaterial wird in die Sättigungssäule eingebracht, die so dimensioniert und deren Gasdurchflußgeschwindigkeit so eingestellt werden sollte, daß eine vollständige Sättigung des Trägergases sichergestellt ist. Die Sättigungssäule muß thermostatisiert werden. Soll bei Temperaturen oberhalb der Raumtemperatur gemessen werden, müssen die Apparaturteile zwischen der Sättigungssäule und den Kühlfallen ebenfalls beheizt werden, um eine Kondensation der Prüfsubstanz zu vermeiden.

Um den durch Diffusion erfolgenden Massetransport zu reduzieren, kann im Anschluß an die Sättigungssäule ein Kapillarröhrchen angebracht werden (Abbildung 6b).

1.6.6.2. Meßvorgang

Vorbereitung der Sättigungssäule:

Man löst die zu untersuchende Substanz in einem sehr fluechtigen Lösungsmittel und gibt sie einer ausreichenden Menge an Trägermaterial zu. Dabei ist eine genügende Menge an Prüfsubstanz hinzuzufügen, um die Sättigung für die gesamte Dauer des Tests zu gewährleisten. Das Lösungsmittel wird an der Luft oder im Rotationsverdampfer vollständig verdampft und das sorgfältig durchgemischte Material in die Sättigungssäule gefuellt. Nach dem Aufheizen der Probe im temperaturkontrollierten Bad wird trockener Stickstoff oder ein anderes geeignetes Trägergas durch die Apparatur geleitet.

Messung:

Man verbindet die Adsorptionsfallen oder den on-line-Detektor mit dem Ausgang der Säule und notiert die Zeit. Zu Beginn und in regelmässigen Abständen während der Messungen kontrolliert man die Durchflußgeschwindigkeit mittels eines Blasenzählers (oder kontinuierlich mit einem Durchflußmesser).

Der Druck am Ausgang der Sättigungssäule muß gemessen werden. Dies geschieht entweder:

(a) durch Zwischenschalten eines Manometers zwischen Säule und Adsorptionsfallen (dies ist möglicherweise keine zufriedenstellende Lösung, da hier das Totvolumen steigt und die Adsorptionsfläche vergrössert wird) oder

(b) durch Bestimmung des Druckabfalls längs der speziellen Adsorptionsfallenanordnung als Funktion der Durchflußgeschwindigkeit (bei Flüssigkeitsfallen möglicherweise nicht sehr zufriedenstellend).

In Vorversuchen oder durch Schätzungen bestimmt man die erforderliche Zeit zur Abscheidung der für die verschiedenen Bestimmungsmethoden benötigten Substanzmenge. Als Alternative zur Dampfabscheidung mit anschließender Analyse lassen sich online-Analysenmethoden (z.B. die Chromatographie) einsetzen. Desgleichen sind Vorversuche zur Bestimmung der maximalen Durchflußgeschwindigkeit durchzuführen, bei der das Trägergas vollständig von dem Dampf der Substanz gesättigt wird, bevor der Dampfdruck bei einer gegebenen Temperatur berechnet wird. Zu diesem Zweck leitet man das Trägergas so langsam in die Sättigungssäule ein, daß sich für eine noch geringere Durchflußgeschwindigkeit kein grösserer berechneter Dampfdruckwert ergibt.

Die verwendete Analysenmethode hängt von der Art der Prüfsubstanz ab (z.B. Gaschromatographie oder Gravimetrie).

Man bestimmt die Substanzmenge, die von einem bekannten Volumen an Trägergas mitgeführt wird.

1.6.6.3. Bestimmung des Dampfdrucks

Der Dampfdruck berechnet sich aus der Dampfdichte W/V mit Hilfe folgender Gleichung:

p =WVRTM

Dabei bedeuten:

p = Dampfdruck (Pa)

W = verdampfte Prüfsubstanz (g)

V = Volumen des gesättigten Gases (m3)

R = universelle molare Gaskonstante (J mol 1 K 1)

T = Temperatur (K)

M = Molargewicht der Prüfsubstanz (g mol 1).

Die gemessenen Volumina müssen wegen der herrschenden Druck- und Temperaturdifferenzen zwischen dem Durchflußmesser und den mit Thermostaten beheizten Sättigungssäulen entsprechend umgerechnet werden. Ist der Durchflußmesser den Adsorptionsfallen nachgeschaltet, so muß mit entsprechenden Korrekturen dem möglicherweise verdampften Inhalt der Fallen Rechnung getragen werden (1).

1.6.7. Rotormethode (8, 11, 13)

1.6.7.1. Apparatur

Dieses Verfahren lässt sich mit einem Rotorviskositätsmeßgerät, wie in Abbildung 8 dargestellt, durchführen. Eine schematische Darstellung der Versuchsanordnung ist in Abbildung 7 enthalten.

Die typische Messapparatur besteht aus einem in einem thermostatisierten Behälter angeordneten Sensorkopf (temperiert auf 0,1 C). Auch das Probengefäß befindet sich in einem thermostatisierten Behälter (temperiert auf 0,01 C). Um eine Kondensation zu vermeiden, werden alle anderen Teile der Anordnung auf einer höheren Temperatur gehalten. Eine Hochvakuum-Pumpe ist über Hochvakuum-Ventile mit dem System verbunden.

Der Sensorkopf besteht aus einer in einem Rohr angeordneten Stahlkugel (Durchmesser 4 bis 5 mm), die in einem Magnetfeld stabilisiert wird und normalerweise mit einer Kombination aus Permanentmagneten und Steuerspulen arbeitet.

Die Kugel wird durch über die Spulen erzeugte Drehfelder zum Rotieren gebracht. Mit Hilfe von Aufnahmespulen, die die stets vorhandene geringe laterale Magnetisierung der Kugel messen, lässt sich deren Drehgeschwindigkeit bestimmen.

1.6.7.2. Meßvorgang

Wenn die Kugel eine vorgegebene Drehgeschwindigkeit v(o) (i.allg. etwa 400 U/s) erreicht hat, wird die weitere Energiezufuhr gestoppt, und es kommt auf Grund der Gasreibung zu einer Abbremsung.

Der Rückgang der Drehgeschwindigkeit wird in Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Da die durch das Magnetfeld erzeugte Reibung im Vergleich zur Gasreibung vernachlässigbar ist, wird der Gasdruck p wie folgt angegeben:

p =pcrrs10tlnv(t)v(o)

Dabei bedeuten:

c = durchschnittliche Geschwindigkeit der Gasmoleküle

r = Radius der Kugel

= Massendichte der Kugel

= Koeffizient der tangentialen Momentübertragung ( = 1 für eine Kugel mit idealer Sphäre)

t = Zeit

v(t) = Drehgeschwindigkeit nach der Zeit t

v(o) = Anfangsdrehgeschwindigkeit.

Diese Gleichung kann auch wie folgt geschrieben werden:

p =pcrr10stn tn-1 tn tn-1

wobei tn, tn 1 die für eine bestimmte Anzahl N von Umdrehungen erforderlichen Zeiten sind. Diese Zeitintervalle tn und tn 1 folgen aufeinander, und tn > tn 1.

Die durchschnittliche Geschwindigkeit des Gasmoleküls c wird durch folgende Gleichung angegeben:

c =(8 RTp M)12

Dabei bedeuten:

T = Temperatur

R = universelle molare Gaskonstante

M = Molargewicht.

2. DATEN

Dampfdruckbestimmungen mit einer der vorstehend beschriebenen Methoden sollten bei mindestens zwei Temperaturen vorgenommen werden. Bevorzugt werden drei oder mehr Bestimmungen im Bereich von 0 C bis 50 C, um den Verlauf der Dampfdruckkurve zu überprüfen.

3. ABSCHLUSSBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- verwendetes Verfahren;

- genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen), ggf. Vorreinigung;

- mindestens zwei Dampfdruck- und Temperaturwerte, vorzugsweise im Bereich 0 C bis 50 C;

- sämtliche Rohdaten;

- eine log p-gegen-1/T-Kurve;

- der geschätzte Dampfdruckwert bei 20 C oder 25 C.

Wird eine Zustandsänderung (Phasenübergang, Zersetzung) festgestellt, sollten folgende Angaben notiert werden:

- Art der Veränderung,

- Temperatur bei Atmosphärendruck, bei der die jeweilige Veränderung auftritt,

- Dampfdruckwerte bei 10 C und 20 C unter- und oberhalb des Punktes, bei dem die Zustandsänderung eintritt (es sei denn, es liegt ein Übergang vom festen in den gasförmigen Zustand vor).

Alle zur Bewertung der Ergebnisse notwendigen Informationen und Bemerkungen sind zu notieren, insbesondere diejenigen über Verunreinigungen und den Aggregatzustand des Stoffes.

4. LITERATUR

(1) ÖCD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) Ambrose, D. B. Le Neindre, B. Vodar, (Hrsg.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II.

(3) R. Weißberger (Hrsg.): Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IX, Interscience Publ. New York, 1959, vol. I, Part I.

(4) Knudsen, M.: Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593.

(5) NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 1 to 105 Pa - Static method.

(6) NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 3 to 1 Pa - Vapour pressure balance method.

(7) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure-temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

(8) G. Messer, P. Röhl, G. Grosse und W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol., (A), 1987, vol. 5 (4), 2440.

(9) Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173.

(10) B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435.

(11) G. Comsa, J.K. Fremerey und B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642.

(12) G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148.

(13) J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol., (A), 1985, vol. 3 (3), 1715.

Anlage 1

Schätzverfahren

EINLEITUNG

Berechnete Dampfdruckwerte können verwendet werden:

- um zu entscheiden, welches der experimentellen Verfahren geeignet ist;

- um einen Schätz- oder Grenzwert in den Fällen zur Verfügung zu haben, in denen das experimentelle Verfahren aus technischen Gründen nicht anwendbar ist (darunter in solchen, bei denen der Dampfdruck sehr niedrig ist);

- um diejenigen Fälle herauszufinden, bei denen der Verzicht auf eine experimentelle Messung gerechtfertigt ist, weil der Dampfdruck bei Raumtemperatur wahrscheinlich ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Apparatur zur Bestimmung der Dampfdruckkurve nach der dynamischen Methode

1 = Thermölement

2 = Vakuumpuffervolumen

3 = Manometer

4 = Vakuum

5 = Meßstelle

6 = Heizelement ca. 150 W

Abbildung 2a

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Apparatur zur Bestimmung der Dampfdruckkurve nach der statischen Methode (unter Verwendung eines U-Rohr-Manometers)

1. Prüfsubstanz

6. Temperierbad

2. Dampfphase

7. Temperaturmeßvorrichtung

3. Hochvakuum-Ventil

8. zur Vakuumpumpe

4. U-Rohr (Hilfsmanometer)

9. Belüftung

5. Manometer

Abbildung 2b

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Apparatur zur Bestimmung der Dampfdruckkurve nach der statischen Methode (unter Verwendung eines Druckaufnehmers)

1. Prüfsubstanz

5. Anzeigegerät

2. Dampfphase

6. Temperierbad

3. Hochvakuum-Ventil

7. Temperaturmeßvorrichtung

4. Druckaufnehmer

Abbildung 3

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Isoteniskop (siehe Literaturstelle 2)

1. zum Druckkontroll- und -meßsystem

2. 8-mm-O.D.-Rohr

3. Trockenstickstoff im Drucksystem

4. Probendampf

5. kleines Plättchen

6. fluessige Probe

Abbildung 4

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Apparatur zur Bestimmung der Dampfdruckkurve mit der Dampfdruckwaage

1. Prüfsubstanz

7. Blende

2. Dampfphase mit Dampfstrom

8. Kühlstab für Kühlkasten

3. Verdampferofen mit Dreheinlaß

3a. Ofendeckel mit Öffnung

9. Waagschale

4. Ofenheizung (-kühlung)

10. Mikrowaage

5. Messung der Probentemperatur

11. zur Registriervorrichtung

6. Kühlkasten

12. zur Hochvakuum-Pumpe

Abbildung 5

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Beispiel einer Apparatur zur Verdampfung bei niedrigem Druck nach der Effusionsmethode - Effusionszell volumen: 8 cm3

1. Vakuumanschluß

2. Bohrungen für das Platin-Widerstandsthermometer oder die Temperaturmessung und -steuerung (2)

3. Deckel des Vakuumbehälters

4. O-Ring

5. Aluminium-Vakuumbehälter

6. Vorrichtung zur Montage und Demontage der Effusionszellen

7. Gewindedeckel

8. Flügelmuttern (6)

9. Schraubenbolzen (6)

10. Effusionszellen aus Edelstahl

11. Heizpatronen (6)

Abbildung 6a

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Beispiel für ein Durchflußsystem zur Bestimmung des Dampfdrucks mit der Gassättigungsmethode

1. Durchflußregler

2. Wärmeaustauscher

3. Nadelventile

4. Sensor zur Messung der relativen Feuchtigkeit

5. Sättigungssäulen

6. PTFE-Dichtungen

7. Durchflußmesser

8. Adsorptionsfalle

9. Ölfalle

10. gesinterter Blasenzähler

Abbildung 6b

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Beispiel für ein System zur Bestimmung des Dampfdrucks mit der Gassättigungsmethode - unter Verwendung eines der Sättigungskammer nachgeschalteten Kapillarröhrchens

1. Wärmeflußmesser

6. Gassättigungskammer

2. Manometer

7. Kapillarröhrchen

3. Thermostierte Kammer

8. Adsorptionsgefässe

4. Thermostat-Spule für Trägergas

9. Gasdruckmesser

5. Thermometer (Pt 100)

10. Kältefalle

Abbildung 7

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Beispiel für eine Versuchsanordnung mit dem Hochgeschwindigkeitsrotor

Apparatur zur Dampfdruckmessung

A. Sensorkopf;

B. Probenzelle;

C. Thermostat;

D. Vakuum (Turbopumpe);

E. Luftthermostat.

Abbildung 8

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Beispiel für einen Hochgeschwindikeitsrotor-Meßkopf

1. Kugel;

2. evakuiertes Verlängerungsrohr von 6;

3. Permanentmagneten (2);

4. Spulen (2) zur vertikalen Stabilisierung;

5. Erregerspulen (4);

6. Flanschverbindung.

A.5. OBERFLÄCHENSPANNUNG

1. METHODEN

Den meisten der hier beschriebenen Methoden liegt die ÖCD-Prüfrichtlinie (1) zugrunde. Die Grundprinzipien sind in (2) angegeben.

1.1. EINLEITUNG

Die hier beschriebenen Methoden sind zur Messung der Oberflächenspannung wäßriger Lösungen anzuwenden.

Zweckdienlich ist, daß vor der Durchführung dieser Prüfungen Vorabinformationen über die Wasserlöslichkeit, die Struktur, die Hydrolyseeigenschaften und die kritische Konzentration für Mizellbildung des Stoffes vorliegen.

Die nachstehenden Methoden können für die meisten chemischen Substanzen ohne Einschränkung in bezug auf ihren Reinheitsgrad angewendet werden.

Die Messung der Oberflächenspannung nach der Ringmethode beschränkt sich auf wäßrige Lösungen mit einer dynamischen Viskosität unter ca. 200 mPa s.

1.2. DEFINITION UND EINHEITEN

Die freie Oberflächenenthalpie pro Oberflächeneinheit bezeichnet man als Oberflächenspannung.

Die Oberflächenspannung wird in folgenden Einheiten angegeben:

N/m (SI-Einheit) oder

mN/m (SI-Untereinheit)

1 N/m = 103 dyn/cm1 mN/m = 1 dyn/cm im veralteten CGS-System

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Referenzsubstanzen müssen nicht in allen Fällen verwendet werden, in denen eine neue Prüfsubstanz untersucht wird. Die Referenzsubstanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.

Referenzsubstanzen, die einen weiten Bereich von Oberflächenspannungen abdecken, sind in der Literatur (1) (3) aufgeführt.

1.4. PRINZIP DER METHODEN

Gemessen wird die maximale Kraft, die in vertikaler Richtung auf einen Bügel oder einen Ring ausgeuebt werden muß, um diesen aus seinem Kontakt mit der Oberfläche der in ein Meßgerät gefuellten Prüffluessigkeit zu ziehen, bzw. die auf eine Platte ausgeuebt werden muß, deren einer Rand in Kontakt mit der Oberfläche steht, um den gebildeten Film hochzuziehen.

Stoffe, die mindestens in einer Konzentration von 1 mg/l in Wasser löslich sind, werden in wäßriger Lösung in einer einzigen Konzentration geprüft.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Die Genauigkeit dieser Methoden überschreitet wahrscheinlich alle Kontrollerfordernisse des Umweltschutzes.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODEN

Eine Lösung der Prüfsubstanz wird in destilliertem Wasser zubereitet. Die Konzentration dieser Lösung sollte bei 90 % der Sättigungslöslichkeit der Substanz in Wasser liegen; wenn diese Konzentration höher liegt als 1 g/l, wird für die Prüfung eine Konzentration von 1 g/l verwendet. Substanzen mit einer Wasserlöslichkeit unter 1 mg/l brauchen nicht geprüft zu werden.

1.6.1. Plattenmethode

Siehe ISO 304 und NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.2. Bügelmethode

Siehe ISO 304 und NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.3. Ringmethode

Siehe ISO 304 und NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.4. ÖCD-Ringmethode

1.6.4.1. Apparatur

Zur Ausführung der in Betracht kommenden Messungen eignen sich handelsübliche Tensiometer. Sie bestehen aus folgenden Teilen:

- einem beweglichen Probentisch,

- einem Kraftmeßsystem,

- einem Meßkörper (Ring),

- einem Meßgefäß.

1.6.4.1.1. Beweglicher Probentisch

Der bewegliche Probentisch dient als Untersatz für das thermostatisierte Meßgefäß, in welchem sich die zu untersuchende Flüssigkeit befindet. Er ist zusammen mit dem Kraftmeßsystem auf ein Stativ montiert.

1.6.4.1.2. Kraftmeßsystem

Das Kraftmeßsystem (siehe Abbildung) befindet sich über dem Probentisch. Der Fehler der Kraftmessung sollte einen Wert von 10 6 N nicht übersteigen, was einer Fehlergrenze von 0,1 mg bei der Massenbestimmung entspricht. In den meisten Fällen erfolgt die Einteilung der Meßskala handelsüblicher Tensiometer in mN/m, so daß die Oberflächenspannung direkt in mN/m mit einer Genauigkeit von 0,1 mN/m abgelesen werden kann.

1.6.4.1.3. Meßkörper (Ring)

Üblicherweise wird der Ring aus Platin-Iridiumdraht mit einer Stärke von etwa 0,4 mm und einem mittleren Umfang von 60 mm hergestellt. Der Drahtring ist horizontal mittels einer Befestigungsgabel aus Draht und einem Metallstift aufgehängt, welche die Verbindung zum Kraftmeßsystem darstellen (siehe Abbildung).

Abbildung

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Meßkörper (alle Abmessungen in mm)

1.6.4.1.4. Meßgefäß

Zur Aufnahme der Prüflösung bei den Messungen sollte ein thermostatisiertes Glasgefäß benutzt werden. Die Anordnung sollte so ausgelegt werden, daß während der Messung die Temperatur sowohl der Prüflösung wie auch die der sich über deren Oberfläche befindlichen Gasphase konstant bleiben und die Probe nicht verdampfen kann. Hierfür sollten zylindrische Glasgefässe mit einem Innendurchmesser von nicht weniger als 45 mm zur Anwendung kommen.

1.6.4.2. Vorbereitung der Apparatur

1.6.4.2.1. Reinigung

Die Glasgefässe müssen sorgfältig gereinigt werden. Falls notwendig, sollten sie mit heisser Chromschwefelsäure und anschließend mit sirupartiger Phosphorsäure (83 bis 98 Gew.-% H3PO4) gewaschen, sorgfältig mit Leitungswasser gespült und schließlich nochmals mit doppelt destilliertem Wasser ausgewaschen werden, bis man eine neutrale Reaktion erhält. Daraufhin trocknet man das Gefäß oder spült es mit der zu untersuchenden Probenlösung aus.

Der Ring sollte zunächst sorgfältig mit Wasser abgewaschen werden, um alle wasserlöslichen Substanzen zu entfernen. Anschließend wird er kurzzeitig in Chromschwefelsäure getaucht, in doppelt destilliertem Wasser bis zur neutralen Reaktion gespült und schließlich kurz über einer Methanolflamme erhitzt.

Anmerkung:

Verunreinigungen durch Substanzen, die weder durch Chromschwefelsäure noch Phosphorsäure gelöst oder zersetzt werden, wie beispielsweise Silikone, sind mittels geeigneter organischer Lösungsmittel zu entfernen.

1.6.4.2.2. Eichung der Apparatur

Die Validierung der Apparatur besteht in einer Überprüfung des Nullpunktes. Dieser sollte so eingestellt werden, daß die Instrumentenanzeige eine zuverlässige Bestimmung in mN/m zulässt.

Aufstellung:

Das Gerät muß waagerecht aufgestellt werden, was sich beispielsweise unter Zuhilfenahme einer Wasserwaage, die man auf die Grundplatte des Tensiometers legt, und entsprechender Einstellungen mit den dort vorgesehenen Stellschrauben erzielen lässt.

Nullpunkteinstellung:

Nach der Befestigung des Rings an der Apparatur und vor dem Eintauchen in die Flüssigkeit sind der Nullpunkt der Tensiometeranzeige einzustellen und die Parallelität des Rings zur Flüssigkeitsoberfläche zu überprüfen. Dazu kann man die Flüssigkeitsoberfläche als Spiegel benutzen.

Eichen:

Das eigentliche Eichen vor den Untersuchungen lässt sich auf zweierlei Weise durchführen:

(a) Benutzung einer Masse: Bei diesem Verfahren verwendet man Reiter bekannter Masse zwischen 0,1 g und 1,0 g, die auf diesem Ring angebracht werden. Der Eichfaktor Öa, mit dem alle am Instrument abgelesenen Werte multipliziert werden müssen, lässt sich entsprechend der Gleichung (1) bestimmen:

fa = srsa(1)

Hierbei ist:

sr = mg2b (mN/m)

m = Masse des Reiters

g = Erdbeschleunigung (981 cm s 2 in Meereshöhe)

b = mittlerer Umfang des Rings (cm)

a = abgelesener Wert am Tensiometer nach dem Anbringen des Reiters auf dem Ring (mN/m).

(b) Verwendung von Wasser: Bei diesem Verfahren benutzt man reines Wasser, dessen Oberflächenspannung bei 23 C einen Wert von 72,3 mN/m besitzt. Dieses Verfahren ist bei weitem schneller durchführbar als die Eichung mit Gewichten, doch läuft man hierbei immer Gefahr, daß die Oberflächenspannung des Wassers durch Spurenverunreinigungen mit oberflächenaktiven Substanzen verfälscht wird.

Der Eichfaktor Öb, mit dem alle am Instrument abgelesenen Werte multipliziert werden müssen, lässt sich entsprechend der Gleichung (2) bestimmen:

fb = sosg(2)

Hierbei ist:

o = angegebener Literaturwert für die Oberflächenspannung von Wasser (mN/m)

g = gemessener Wert der Oberflächenspannung von Wasser (mN/m)

beide bei der gleichen Temperatur.

1.6.4.3. Vorbereitung der Proben

Von den zu untersuchenden Substanzen sind wäßrige Lösungen in den erforderlichen Konzentrationen herzustellen. Die Lösungen dürfen keine ungelösten Bestandteile enthalten.

Die Lösung ist bei konstanter Temperatur zu halten ( 0,5 C). Da sich die Oberflächenspannung der im Meßbehälter befindlichen Lösung im Verlauf der Zeit verändert, sollten Messungen zu verschiedenen Zeitpunkten vorgenommen und entsprechend eine Kurve erstellt werden, die die Oberflächenspannung in Abhängigkeit von der Zeit darstellt. Ein Gleichgewichtszustand ist erreicht, sobald keine weiteren Änderungen auftreten.

Verschmutzung durch Staub oder gasförmige Substanzen beeinträchtigt die Messung. Aus diesem Grunde sollten die Arbeiten unter einer Schutzhaube vorgenommen werden.

1.6.5. Prüfbedingungen

Die Messungen sind bei etwa 20 C auszuführen, und die Temperaturkonstanz sollte mit 0,5 C eingehalten werden.

1.6.6. Durchführung der Prüfung

Die zu messenden Lösungen werden in das sorgfältig gereinigte Meßgefäß gefuellt, wobei darauf geachtet werden sollte, Schaumbildung zu vermeiden. Anschließend wird das Meßgefäß auf den Tisch der Testapparatur gestellt. Das Tischoberteil mit dem Meßgefäß wird nun so weit hochgeschraubt, bis der Ring unter die Oberfläche der zu messenden Lösung taucht. Daraufhin wird das Tischoberteil langsam und gleichmässig abgesenkt (mit einer Geschwindigkeit von ca. 0,5 cm/min), um den Ring aus der Oberfläche herauszuziehen, bis ein maximaler Wert der Kraft erreicht ist. Der am Ring haftende Flüssigkeitsfilm darf nicht von ihm abreissen. Nach Beendigung der Messung wird der Ring wieder unter die Oberfläche getaucht und der Vorgang wiederholt, bis ein konstanter Wert der Oberflächenspannung erreicht ist. Bei jeder Bestimmung sollte die Zeitmessung mit dem Einfuellen der Lösung in das Meßgefäß beginnen. Die Ablesung erfolgt jeweils zu dem Zeitpunkt, bei dem die Maximalkraft beim Herausziehen des Rings aus der Flüssigkeitsoberfläche erreicht ist.

2. DATEN

Zur Berechnung der Oberflächenspannung wird zunächst der in mN/m an der Apparatur abgelesene Wert mit dem Eichfaktor Öa oder Öb (je nach dem verwendeten Eichverfahren) multipliziert. Man erhält einen Wert, der jedoch nur annähernd gilt und infolgedessen einer Korrektur bedarf.

Harkins und Jordan (4) haben empirische Korrekturfaktoren für Oberflächenspannungswerte bestimmt, die mit der Ringmethode gemessen wurden. Diese Faktoren sind von den Ringdimensionen, der Dichte der Flüssigkeit und ihrer Oberflächenspannung abhängig.

Da es umständlich ist, für jede einzelne Messung den Korrekturfaktor aus den Tabellen von Harkins und Jordan zu bestimmen, um die Oberflächenspannung wäßriger Lösungen zu berechnen, kann eine vereinfachte Methode angewandt werden, die darin besteht, die korrigierten Werte für die Oberflächenspannung direkt aus der nach-stehenden Tabelle abzulesen. (Für Ablesewerte, die zwischen den Tabellenwerten liegen, ist eine Interpolation möglich.)

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Die Zusammenstellung dieser Tabelle erfolgte auf der Grundlage der Harkins-Jordan-Korrekturen und entsprechend der DIN-Norm (DIN 53914) für Wasser und wäßrige Lösungen (Dichte = 1 g/cm3). Sie gilt für einen handelsüblichen Ring mit folgenden Abmessungen: R = 9,55 mm (mittlerer Ringradius) und r = 0,185 mm (Radius des Ringdrahtes). Die Tabelle enthält korrigierte Werte für Oberflächenspannungsmessungen nach einer Eichung entweder mit Gewichten oder mit Wasser.

Alternativ lässt sich die Oberflächenspannung ohne vorhergehende Eichung nach der folgenden Gleichung berechnen:

s = 4 p Rf F

wobei

F = die vom Kraftmeßsystem angegebene Kraft beim Abreissen des Films,

R = der Ringradius,

f = der Korrekturfaktor (1) sind.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- verwendete Methode;

- Art des verwendeten Wassers oder der verwendeten Lösung;

- genaue Spezifizierung der Substanz (Identifizierung und Verunreinigungen);

- Messergebnisse: abgelesene Oberflächenspannungswerte mit Angabe sowohl der Einzelmeßwerte und ihres arithmetischen Mittels wie auch des korrigierten Mittelwertes (wobei der Eichfaktor und die Korrekturtabelle berücksichtigt werden);

- die Konzentration der Lösung;

- die Prüftemperatur;

- das Alter der untersuchten Lösung, insbesondere die Zeitspanne zwischen Zubereitung und Messung der Lösung;

- die Darstellung der Zeitabhängigkeit der Oberflächenspannung nach Einfuellen der Lösung in das Meßgefäß;

- alle für die Auswertung der Ergebnisse sachdienlichen Informationen und Bemerkungen, insbesondere in bezug auf Verunreinigungen und Aggregatzustand des Stoffes.

3.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE

Ausgehend davon, daß destilliertes Wasser bei 20 C eine Oberflächenspannung von 72,75 mN/m hat, sollten Stoffe mit einer Oberflächenspannung unter 60 mN/m unter den Bedingungen dieses Verfahrens als oberflächenaktiv betrachtet werden.

4. LITERATUR

(1) ÖCD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) R. Weißberger (Hrsg.), Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.

(3) Pure Appl. Chem., 1976, Vol. 48, 511.

(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, Vol. 52, 1751.

A.6 WASSERLÖSLICHKEIT

1. METHODE

Den hier beschriebenen Methoden liegt die ÖCD-Prüfrichtlinie (1) zugrunde.

1.1. EINLEITUNG

Vor Durchführung dieser Prüfung sollten Vorinformationen über die Strukturformel, den Dampfdruck, die Dissoziationskonstante und das Hydrolyseverhalten (als Funktion des pH-Wertes) des Stoffes vorliegen.

Für den gesamten Bereich der Wasserlöslichkeit reicht eine einzige Methode nicht aus.

Die beiden nachstehend beschriebenen Prüfmethoden decken den gesamten Bereich der Löslichkeiten ab, eignen sich jedoch nicht für fluechtige Stoffe:

- eine Prüfmethode für im wesentlichen reine Substanzen geringer Löslichkeit ( 10 2 g/l), die in Wasser stabil sind; diese Methode wird als "Kolben-Methode" bezeichnet.

Die Wasserlöslichkeit der Prüfsubstanz kann durch Verunreinigungen erheblich beeinflusst werden.

1.2. DEFINITION UND EINHEITEN

Die Wasserlöslichkeit einer Substanz wird durch ihre Massen-Sättigungskonzentration in Wasser bei einer bestimmten Temperatur angegeben. Die Wasserlöslichkeit wird in Masseneinheiten pro Lösungsvolumen angegeben. Die SI-Einheit ist kg/m3 (g/l kann auch benutzt werden).

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Referenzsubstanzen müssen nicht in allen Fällen verwendet werden, in denen eine neue Prüfsubstanz untersucht wird. Die Referenzsubstanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.

1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE

Die ungefähre Probenmenge und die zum Erreichen der Sättigungskonzentration notwendige Zeit sollen in einem einfachen Vorversuch bestimmt werden.

1.4.1. Säulen-Elutions-Methode

Diese Methode basiert auf der Elution einer Prüfsubstanz mit Wasser aus einer Mikro-Säule, die mit einem inerten Trägermaterial wie Glaskugeln oder Sand gefuellt ist, welches mit einem Überschuß an Prüfsubstanz beschichtet ist. Die Wasserlöslichkeit wird bestimmt, wenn die Massenkonzentrationen aufeinanderfolgender Eluatfraktionen konstant sind. Dies zeigt sich in einem Konzentrationsplateau in Abhängigkeit von der Zeit.

1.4.2. Kolben-Methode

Bei dieser Methode wird die Substanz (Feststoffe müssen pulverisiert werden) bei einer Temperatur in Wasser aufgelöst, die leicht über der Prüftemperatur liegt. Wenn die Sättigung erreicht ist, wird die Lösung abgekühlt und bei der Prüftemperatur gehalten. Die Lösung wird gerührt, bis das Gleichgewicht erreicht ist. Alternativ kann die Messung unmittelbar bei der Prüftemperatur durchgeführt werden, wenn durch entsprechende Probenahme gesichert ist, daß das Sättigungsgleichgewicht erreicht ist. Dann wird die Konzentration der Prüfsubstanz in der wäßrigen Lösung, die keine ungelösten Substanzteilchen enthalten darf, mit einer geeigneten Analysenmethode bestimmt.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

1.5.1. Wiederholbarkeit

Bei der Säulen-Elutions-Methode ist eine Wiederholbarkeit von 3 %/ C vorzuliegen scheint, wird bei zwei weiteren Temperaturen, die mindestens 10 C unter und über der ursprünglich gewählten Temperatur liegen, ebenfalls gemessen. In diesem Fall sollte die Temperaturkonstanz bei 0,1 C liegen. Die gewählte Temperatur soll in den wichtigen Teilen der Apparatur konstant gehalten werden.

1.6.2. Vorversuch

Etwa 0,1 g der Probe (feste Substanzen müssen pulverisiert sein) werden in einem mit Glasstopfen verschließbaren 10-ml-Meßzylinder gegeben. Gemäß der Tabelle wird portionsweise destilliertes Wasser von Raumtemperatur zugesetzt.

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Nach jedem Zusatz der in der Tabelle angegebenen Wassermenge wird die Mischung 10 min kräftig geschüttelt und mit blossem Auge auf ungelöste Teilchen untersucht. Wenn nach Zusatz von 10 ml Wasser die Probe oder Teile von ihr ungelöst bleiben, ist der Versuch in einem 100-ml-Meßzylinder mit grösseren Mengen Wasser zu wiederholen. Bei geringer Löslichkeit kann die zur Auflösung einer Substanz erforderliche Zeit erheblich länger sein (bis zu 24 Stunden). Die ungefähre Löslichkeit ist in der Tabelle angegeben, und zwar unter dem Volumen des zur vollständigen Auflösung der Probe notwendigen Wassers. Ist die Substanz noch immer nicht vollständig gelöst, sollte der Versuch länger als 24 Stunden (maximal 96 Stunden) durchgeführt oder weiter verdünnt werden, um festzustellen, ob entweder die Säulen-Elutions- oder die Kolben-Methode zu benutzen ist.

1.6.3. Säulen-Elutions-Methode

1.6.3.1. Trägermaterial, Lösungsmittel und Elünt

Das Trägermaterial für das Säulen-Elutionsverfahren muß inert sein. Geeignete Trägermaterialien sind Glaskugeln und Sand. Zur Aufbringung der Prüfsubstanz auf das Trägermaterial sollte ein geeignetes fluechtiges und analytisch reines Lösungsmittel benutzt werden. Als Elünt wird in einer Glas- oder Quarz-Apparatur doppelt destilliertes Wasser verwendet.

Anmerkung:

Direkt aus einem organischen Ionenaustauscher entnommenes Wasser sollte nicht benutzt werden.

1.6.3.2. Aufbringung auf das Trägermaterial

Etwa 600 mg Trägermaterial werden abgewogen und in einen 50-ml-Rundkolben eingefuellt.

Eine geeignete Menge Prüfsubstanz wird abgewogen und in dem vorgesehenen Lösungsmittel gelöst. Eine ausreichende Menge dieser Lösung wird zum Trägermaterial hinzugefügt. Das Lösungsmittel muß vollständig abgezogen werden, z.B. in einem Rotationsverdampfer, da sonst wegen Verteilungseffekten auf der Oberfläche des Trägermaterials keine vollständige Sättigung dieses Materials mit Wasser erzielt wird.

Das Aufbringen der Prüfsubstanz auf das Trägermaterial kann problematisch werden (fehlerhafte Ergebnisse), wenn sich die Prüfsubstanz ölartig oder als eine andere Kristallphase auf dem Träger niederschlägt. Dieser Sachverhalt sollte experimentell untersucht und Einzelheiten dazu mitgeteilt werden.

Das beladene Trägermaterial lässt man etwa 2 Stunden lang in etwa 5 ml Wasser quellen. Dann wird die Suspension in die Mikrosäule gefuellt. Es ist auch möglich, das trockene, beladene Trägermaterial in die Mikrosäule zu fuellen, die zuvor mit Wasser gefuellt wurde. Auch hier wird der Quellvorgang von etwa 2 Stunden abgewartet.

Weitere Versuchsdurchführung:

Die Elution der Prüfsubstanz vom Trägermaterial kann auf zwei verschiedene Arten vorgenommen werden:

- mit einer Umwälzpumpe (siehe Abbildung 1),

- mit einem Niveaugefäß (siehe Abbildung 4).

1.6.3.3. Säulen-Elution mit der Umwälzpumpe

Apparatur:

Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung eines typischen Systems. Eine geeignete Mikrosäule ist in Abbildung 2 dargestellt. Allerdings ist jede andere Grösse ebenfalls akzeptabel, vorausgesetzt, sie erfuellt die Kriterien der Vergleichbarkeit und Empfindlichkeit. Der Kopfraum der Säule sollte die Grösse von mindestens fünf Säulenbett-Volumina Wasser haben und mindestens fünf Proben aufnehmen können. Der Kopfraum kann kleiner gehalten werden, wenn die anfänglich mit den Verunreinigungen entnommenen fünf Säulenbett-Volumina durch Nachfuellen von Lösungsmittel ersetzt werden.

Die Säule sollte mit einer Umwälzpumpe verbunden werden, die einen Fluß von etwa 25 ml/h fördert. Die Pumpe wird mit Polytetrafluorethylen-Schläuchen (PTFE) und/oder Glasrohren angeschlossen. Bei der aus Säule und Pumpe zusammengesetzten Apparatur soll eine Möglichkeit zur Entnahme von Eluat-Proben und zum Druckausgleich des Kopfraumes mit der Atmosphäre vorgesehen sein. Das beladene Trägermaterial wird durch einen kleinen (5 mm) Propfen aus Glaswolle in der Säule gehalten, der gleichzeitig zum Herausfiltern von Partikeln dient. Die Umwälzpumpe kann z.B. eine Schlauch- oder eine Membranpumpe sein. (Dabei ist darauf zu achten, daß es nicht zu einer Verunreinigung und/oder Absorption durch das Schlauchmaterial kommt.).

Meßverfahren:

Der Säulenfluß wird in Gang gesetzt. Eine Durchflußleistung von etwa 25 ml/h wird empfohlen (etwa 10 Säulenbett-Volumina/h bei der beschriebenen Säule). Die ersten fünf Säulenbett-Volumina (mindestens) werden verworfen, um wasserlösliche Verunreinigungen zu entfernen. Danach lässt man die Umwälzpumpe bis zur Einstellung des Gleichgewichts laufen. Das Gleichgewicht ist erreicht, wenn bei fünf aufeinanderfolgenden Proben die Konzentrationen um nicht mehr als 30 % streuen. Diese Proben sollten in solchen zeitlichen Abständen genommen werden, in denen mindestens zehn Säulenbett-Volumina der Lösung die Säule durchlaufen haben.

1.6.3.4. Säulen-Elution mit dem Niveaugefäß

Apparatur (siehe Abbildungen 4 und 3)

Niveaugefäß: Der Anschluß des Niveaugefässes wird mit einem Glasschliff-Verbindungsstück vorgenommen, das mit einem PTFE-Schlauch verbunden ist. Eine Durchflußrate von ca. 25 ml/h wird empfohlen. Aufeinanderfolgende Eluat-Fraktionen werden gesammelt und ihre Konzentrationen mit der gewählten Analysenmethode bestimmt.

Meßverfahren:

Diejenigen Fraktionen des mittleren Eluatbereichs, bei denen die Konzentrationen in mindestens fünf aufeinanderfolgenden Proben konstant bleiben ( 30 %), werden zur Bestimmung der Wasserlöslichkeit benutzt.

In beiden Fällen (bei Verwendung einer Umlaufpumpe ebenso wie bei Verwendung eines Niveaugefässes) wird ein zweiter Durchlauf mit halber Durchflußrate durchgeführt. Stimmen die Ergebnisse der beiden Versuche überein, wird das Prüfergebnis als zufriedenstellend betrachtet. Ist die Löslichkeit bei dem niedrigeren Durchfluß höher, muß die Durchflußleistung weiterhin so lange halbiert werden, bis zwei aufeinanderfolgende Versuchsdurchläufe die gleiche Löslichkeit ergeben.

In beiden Fällen (sowohl mit Umwälzpumpe als auch mit dem Niveaugefäß) sollten die Fraktionen durch Prüfung des Tyndall-Effekts (Lichtstreuung) auf kolloidale Substanzpartikel untersucht werden. Wenn solche Substanzpartikel in der Lösung vorkommen, ist das Prüfergebnis unbrauchbar. Die Prüfung sollte dann wiederholt werden, nachdem die Filterfunktion der Säule verbessert wurde.

Der pH-Wert jeder Probe sollte aufgenommen werden. Ein zweiter Durchlauf sollte bei der gleichen Temperatur durchgeführt werden.

1.6.4. Kolben-Methode

1.6.4.1. Geräte

Für die Kolbenmethode braucht man folgende Geräte:

- übliche Laborglasgeräte und -instrumente,

- eine Vorrichtung zum Schütteln der Lösungen bei konstanter Temperatur,

- eine Zentrifuge (möglichst thermostatisiert), falls diese bei Emulsionen erforderlich wird,

- Geräte für analytische Bestimmungen.

1.6.4.2. Meßverfahren

Die zur Sättigung des vorgegebenen Wasservolumens erforderliche Prüfsubstanzmenge wird anhand der Ergebnisse des Vorversuches abgeschätzt. Das erforderliche Wasservolumen hängt von der Analysenmethode sowie dem Löslichkeitsbereich ab. Etwa fünfmal soviel Prüfsubstanz wie die geschätzte Menge wird jeweils in drei mit Glasstopfen versehene Glasgefässe eingefuellt (z.B. Zentrifugenröhrchen oder Kolben). Das gewählte Wasservolumen wird allen Gefässen zugesetzt, die daraufhin fest verschlossen werden. Die geschlossenen Gefässe werden dann bei 30 C geschüttelt (Dazu sollte ein Schüttel- oder Rührgerät, das bei konstanter Temperatur arbeitet, verwendet werden, z.B. magnetisches Rühren in einem thermostatisierten Wasserbad). Nach einem Tag wird eines der Gefässe entnommen und 24 h unter gelegentlichem Schütteln bei Prüftemperatur stehengelassen, bis sich das Gleichgewicht wieder eingestellt hat. Dann wird der Inhalt des Gefässes bei Prüftemperatur zentrifugiert und die Konzentration der Prüfsubstanz in der klaren wäßrigen Phase mit einem geeigneten Analysenverfahren bestimmt. Mit den beiden anderen Kolben wird nach zwei bzw. drei Tagen genauso verfahren, nachdem zuvor das Sättigungsgleichgewicht bei 30 C eingestellt wurde. Entsprechen die Prüfergebnisse - mindestens die der beiden letzten Kolben - der geforderten Wiederholbarkeit, ist die Prüfung als zufriedenstellend anzusehen. Die gesamte Prüfung sollte unter Verlängerung der Zeiten für die Gleichgewichtseinstellung wiederholt werden, wenn die Prüfergebnisse der Kolben 1, 2 und 3 eine steigende Tendenz aufweisen.

Das Meßverfahren kann auch ohne Präinkubation bei 30 C durchgeführt werden. Um den Grad des erreichten Sättigungsgleichgewichts zu bestimmen, werden so lange Proben entnommen, bis die Konzentration der Prüflösung nicht länger von der Rührzeit beeinflusst wird.

Der pH-Wert jeder Probe sollte aufgenommen werden.

1.6.5. Analyse

Für diese Bestimmungen ist eine substanzspezifische Analysenmethode vorzuziehen, da bereits kleine Mengen von löslichen Verunreinigungen grosse Fehler bei der Bestimmung der Löslichkeit verursachen können. Beispiele für solche Analysenmethoden sind: Gas- oder Flüssigkeitschromatographie, Titrierverfahren, photometrische Methoden, voltametrische Verfahren.

2. DATEN

2.1. SÄULEN-ELUTIONS-METHODE

Es wird der Mittelwert von mindestens fünf aufeinanderfolgenden Proben aus dem Bereich des Sättigungsplateaus berechnet, wie auch die Standardabweichung. Die Einheiten sollten in Masseneinheiten pro Lösungsvolumen angegeben werden.

Die für zwei Prüfungen mit unterschiedlichen Durchflußleistungen berechneten Mittelwerte sollten verglichen werden. Dabei sollte die Wiederholbarkeit bei unter 30 % liegen.

2.2. KOLBEN-METHODE

Die einzelnen Ergebnisse sollten für jeden der drei Kolben angegeben werden. Diejenigen Ergebnisse, die als konstant angesehen werden (Wiederholbarkeit unter 15 %), sollten gemittelt und in Masseneinheiten pro Lösungsvolumen angegeben werden. Bei sehr hoher Löslichkeit (> 100 g/l) kann es notwendig sein, die Masseneinheiten mittels der Dichte in Volumeneinheiten umzuwandeln.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. SÄULEN-ELUTIONS-METHODE

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- die Ergebnisse des Vorversuchs;

- genaue Spezifizierung der Substanz (Identität und Verunreinigungen);

- die Konzentrationen, Durchflußraten und pH-Werte jeder Probe;

- die Mittelwerte und Standardabweichungen von mindestens fünf Proben aus dem Bereich des Sättigungsplateaus eines jeden Versuches;

- den Durchschnittswert aus zwei aufeinanderfolgenden zufriedenstellenden Durchläufen;

- die Temperatur des Wassers während des Sättigungsvorgangs;

- das verwendete Analysenverfahren;

- die Art des verwendeten Trägermaterials;

- die Beladung des Trägermaterials;

- das verwendete Lösungsmittel;

- ggf. Hinweise auf eine chemische Instabilität der Prüfsubstanz während des Prüfungsvorgangs und auf die hierfür angewendete Analysenmethode;

- alle für die Auswertung der Ergebnisse sachdienlichen Informationen und Bemerkungen, insbesondere in Bezug auf Verunreinigungen und den Aggregatzustand des Stoffes.

3.2. KOLBEN-METHODE

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- die Ergebnisse des Vorversuchs;

- genaue Spezifizierung der Substanz (Identität und Verunreinigungen);

- die einzelnen Analysenergebnisse und die Durchschnittswerte, wenn pro Kolben mehr als ein Wert bestimmt wurde;

- den pH-Wert jeder Probe;

- den Mittelwert von denjenigen Kolben, deren Ergebnisse übereinstimmen;

- die Prüftemperatur;

- das verwendete Analysenverfahren;

- ggf. Hinweise auf eine chemische Instabilität der Prüfsubstanz während des Prüfungsvorgangs und auf die hierfür angewendete Analysenmethode;

- alle für die Auswertung der Ergebnisse sachdienlichen Informationen und Bemerkungen, insbesondere in Bezug auf Verunreinigungen und den Aggregatzustand des Stoffes.

4. LITERATUR

(1) ÖCD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method

(3) NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Flask method.

Anlage

Abbildung 1

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Säulen-Elutions-Methode mit Umwälzpumpe

Abbildung 2

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Typische Mikrosäule

(alle Abmessungen in mm)

Abbildung 3

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Typische Mikrosäule

(alle Abmessungen in mm)

Abbildung 4

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Säulen-Elutions-Methode mit Niveaugefäß

1 = Niveaugefäß (z.B. 2,5-l-Kolben)

2 = Säule (siehe Abbildung 3)

3 = Fraktionssammler

4 = Thermostat

5 = Teflonschlauch

6 = Glasschliff-Stopfen

7 = Wasserschlauch (zwischen Thermostat und Säule, Innendurchmesser ungefähr 8 mm)

A.8 VERTEILUNGSKÖFFIZIENT

1. METHODE

Der hier beschriebenen Schüttelmethode liegt die ÖCD-Prüfrichtlinie (1) zugrunde.

1.1. EINLEITUNG

Zur Durchführung der Prüfung ist es nützlich, Vorinformationen über die Strukturformel, die Dissoziationskonstante, die Wasserlöslichkeit, das Hydrolyseverhalten, die n-Oktanol-öslichkeit und die Oberflächenspannung des Stoffes in wäßriger Lösung zu haben.

Messungen von ionischen Substanzen sollten nur an deren nicht ionisierter Form (freie Säure oder freie Base) durch Verwendung eines geeigneten Puffers mit einem pH-Wert von mindestens einer pH-Einheit unter (freie Säure) oder über (freie Base) dem pK-Wert durchgeführt werden.

Diese Prüfmethode beinhaltet zwei getrennte Verfahren: die Schüttelmethode und die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Die erstere findet dann Anwendung, wenn der log Pow-Wert (Definitionen siehe unten) im Bereich 2 bis 4 liegt, die letztere dann, wenn dieser Wert im Bereich 0 bis 6 liegt. Vor der Messung mit einer der beiden Methoden sollte eine Vorab-Schätzung des Verteilungsköffizienten durchgeführt werden.

Die Schüttelmethode gilt nur für im wesentlichen reine Substanzen, die in Wasser und n-Oktanol löslich sind. Sie ist nicht auf oberflächenaktive Stoffe anwendbar (für diese sollte ein berechneter oder ein geschätzter Wert auf der Grundlage der einzelnen Löslichkeiten in n-Oktanol und Wasser vorgelegt werden).

Die HPLC-Methode ist nicht für starke Säuren und Basen, Metall-Komplexe, oberflächenaktive Stoffe oder für Substanzen anwendbar, die mit dem Elünten reagieren. Für diese Stoffe sollte ein berechneter oder ein geschätzter Wert auf der Grundlage der einzelnen Löslichkeiten in n-Oktanol und Wasser vorgelegt werden.

Die HPLC-Methode ist bezueglich Verunreinigungen in der Prüfsubstanz weniger empfindlich als die Schüttelmethode. Dennoch kann die Interpretation der Ergebnisse in einigen Fällen durch das Vorliegen von Verunreinigungen erschwert werden, weil die Zuordnung der Peaks nicht eindeutig ist. Für Mischungen, die ein nicht aufgelöstes Band ergeben, sollten die obere und die untere Grenze des Zehnerlogarithmus (log P) angegeben werden.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Als Verteilungsköffizient (P) bezeichnet man das Verhältnis der Gleichgewichtskonzentrationen (ci) einer gelösten Substanz in einem Zweiphasensystem aus zwei weitgehend unmischbaren Lösungsmitteln. Im Falle von n-Oktanol und Wasser ergibt sich:

Pow = cn-OktanolcWasser

Der Verteilungsköffizient (P) ist somit der Quotient zweier Konzentrationen. Er wird gewöhnlich in Form seines Zehnerlogarithmus (log P) angegeben.

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Schüttelmethode

Referenzsubstanzen müssen nicht in allen Fällen verwendet werden, in denen eine neue Prüfsubstanz untersucht wird. Die Referenzsubstanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.

HPLC-Methode

Um die HPLC-Meßdaten einer Substanz mit deren P-Wert zu korrelieren, ist eine Eichkurve log P/chromatographische Daten unter Verwendung von mindestens sechs Bezugspunkten aufzustellen. Die Wahl der geeigneten Referenzsubstanzen obliegt dem Benutzer. Soweit möglich, sollte mindestens eine Referenzsubstanz einen Pow-Wert über dem der Prüfsubstanz und eine andere einen Pow-Wert unter dem der Prüfsubstanz haben. Für log P-Werte unter 4 kann bei der Eichung von Daten ausgegangen werden, die mit Hilfe der Schüttelmethode erhalten worden sind. Für log P-Werte über 4 kann man sich bei der Eichung auf kalibrierte Literaturwerte stützen, sofern diese mit den berechneten Werten übereinstimmen. Aus Gründen einer grösseren Genauigkeit sollten vorzugsweise Referenzsubstanzen verwendet werden, die strukturell mit der Prüfsubstanz verwandt sind.

Es liegen umfangreiche Listen mit log Pow-Werten für zahlreiche Gruppen von Chemikalien vor (2)(3). Wenn keine Verteilungsköffizienten zu strukturell verwandten Verbindungen vorhanden sind, kann eine allgemeinere Eichung auf der Grundlage anderer Referenzsubstanzen vorgenommen werden.

Eine Liste der empfohlenen Referenzsubstanz und deren Pow-Werten ist in Anlage 2 enthalten.

1.4. PRINZIP DER METHODE

1.4.1. Schüttelmethode

Zur Bestimmung des Verteilungsköffizienten müssen nach Einstellung des Gleichgewichts zwischen allen wechselwirkenden Komponenten des Verteilungssystems die Konzentrationen der in beiden Phasen gelösten Substanz ermittelt werden. Die einschlägige Literatur zeigt, daß hierfür verschiedene Techniken vorhanden sind, wie z.B. die gründliche Mischung der beiden Phasen mit anschließender Phasentrennung zur Bestimmung der Gleichgewichtskonzentration der untersuchten Substanz.

1.4.2. HPLC-Methode

Die HPLC-Methode wird an Analysensäulen durchgeführt, die mit einer handelsüblichen festen Phase mit langen, chemisch an Siliziumdioxid gebundenen Kohlenwasserstoffketten (z.B. C8, C18) gefuellt sind. Chemikalien, die in eine solche Säule eingespritzt werden, bewegen sich darin wegen der unterschiedlichen Verteilungsgrade zwischen der mobilen und der stationären (Kohlenwasserstoffe) Phase mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Substanzgemische werden entsprechend dem hydrophoben Charakter der Bestandteile eluiert - zuerst die wasserlöslichen und zuletzt die öllöslichen; dabei erfolgt die Elution proportional zum jeweiligen Kohlenwasserstoff-Wasser-Verteilungsköffizienten. Dadurch kann die Beziehung zwischen der Retentionszeit an einer solchen (Phasenumkehr-)Säule und dem Verteilungsköffizienten für n-Oktanol/Wasser aufgestellt werden. Der Verteilungsköffizient wird vom Kapazitätsfaktor k über die Formel

k = tR toto

abgeleitet, wobei tR die Retentionszeit der Prüfsubstanz und to die durchschnittliche Zeit ist, die ein Lösungsmittelmolekül für die Wanderung durch die Säule benötigt (Totzeit).

Quantitative Analysenmethoden sind nicht erforderlich; es müssen lediglich die Elutionszeiten bestimmt werden.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

1.5.1. Wiederholbarkeit

Schüttelmethode

Um die Genauigkeit des Verteilungsköffizienten zu gewährleisten, sind Doppelbestimmungen bei drei verschiedenen Prüfbedingungen durchzuführen. Dazu sollen sowohl die eingesetzte Menge der untersuchten Substanz als auch das Verhältnis der Lösungsmittelvolumina verändert werden. Die so ermittelten Werte des Verteilungsköffizienten, angegeben als deren Zehnerlogarithmus, sollen in einem Bereich von 0,3 log-Einheiten liegen.

HPLC-Methode

Um die Zuverlässigkeit der Messung zu erhöhen, sind Doppelbestimmungen durchzuführen. Die aus den Einzelmessungen abgeleiteten log P-Werte sollen in einem Bereich von 0,1 log-Einheiten liegen.

1.5.2. Empfindlichkeit

Schüttelmethode

Der Meßbereich der Methode wird durch die Nachweisgrenze des Analysenverfahrens festgelegt. Dieses sollte die Bestimmung von log Pow-Werten innerhalb eines Bereichs von 2 bis 4 erlauben (sofern es die Bedingungen zulassen, kann dieser Bereich gelegentlich auf Pow-Werte bis 5 erweitert werden, wenn die Konzentration der gelösten Substanz in keiner Phase grösser als 0,01 Mol/l ist).

HPLC-Methode

Die HPLC-Methode erlaubt die Bestimmung von Verteilungsköffizienten innerhalb eines Pow-Bereichs von 0 bis 6.

Normalerweise lässt sich der Verteilungsköffizient einer Verbindung innerhalb eines Bereichs von 1 log-Einheit des bei der Schüttelmethode gewonnenen Wertes bestimmen. Typische Korrelationen sind in der Literatur angegeben (4)(5)(6)(7)(8). Eine höhere Genauigkeit ist gewöhnlich zu erreichen, wenn die Korrelationskurven von strukturell verwandten Referenzsubstanzen ausgehen (9).

1.5.3. Anwendbarkeit

Schüttelmethode

Das Nernst'sche Verteilungsgesetz gilt nur für verdünnte Lösungen bei konstanter Temperatur, konstantem Druck und pH-Wert. Es gilt streng nur für eine reine Substanz, die zwischen zwei reinen Lösungsmitteln verteilt ist. Wenn mehrere gelöste Stoffe in einer oder beiden Phasen gleichzeitig vorkommen, kann dadurch das Ergebnis beeinflusst werden.

Dissoziation oder Assoziation gelöster Moleküle führen zu Abweichungen vom Nernst'schen Verteilungsgesetz. Solche Abweichungen zeigen sich darin, daß der Verteilungsköffizient von der Konzentration der Lösung abhängig wird.

Wegen der auftretenden multiplen Verteilungsgleichgewichte sollte diese Prüfmethode für ionische Verbindungen nicht ohne entsprechende Korrekturen angewendet werden. Für derartige Verbindungen sollte die Benutzung von Pufferlösungen anstelle von Wasser erwogen werden; dabei sollte der pH-Wert des Puffers mindestens 1 pH-Einheit vom pKa-Wert der Substanz entfernt sein und die Bedeutung dieses pH-Wertes für die Umwelt berücksichtigt werden.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Abschätzung des Verteilungsköffizienten

Der Verteilungsköffizient wird vorzugsweise durch ein Berechnungsverfahren abgeschätzt (siehe Anlage 1); wo möglich, kann er aus dem Löslichkeitsverhältnis der Prüfsubstanz in den reinen Lösungsmitteln abgeschätzt werden (10).

1.6.2. Schüttelmethode

1.6.2.1. Vorbereitung

n-Oktanol: Die Bestimmung des Verteilungsköffizienten soll mit sehr reinem Reagens durchgeführt werden.

Wasser: Es soll in Glas- oder Quarzgefässen destilliertes bzw. doppelt destilliertes Wasser verwendet werden. Für ionische Verbindungen sollten, wenn begründbar, anstelle von Wasser Pufferlösungen verwendet werden.

Anmerkung: Direkt aus einem Ionenaustauscher entnommenes Wasser soll nicht benutzt werden.

1.6.2.1.1. Vorsättigung der Lösungsmittel

Vor der Bestimmung des Verteilungsköffizienten werden die Phasen des Lösungsmittelsystems durch Schütteln bei Prüftemperatur gegenseitig gesättigt. Dazu ist es zweckmässig, zwei grosse Vorratsflaschen gefuellt mit sehr reinem n-Oktanol bzw. Wasser mit jeweils einer ausreichenden Menge des anderen Lösungsmittels zu versetzen, mit einem mechanischen Schüttelapparat 24 Stunden zu schütteln und dann so lange stehen zu lassen, bis sich die Phasen getrennt haben und der Sättigungszustand erreicht ist.

1.6.2.1.2. Vorbereitung der Prüfung

Das Gesamtvolumen des Zweiphasensystems soll das Prüfgefäß nahezu ausfuellen. Dadurch können Materialverluste aufgrund von Verdampfung verhindert werden. Das Volumenverhältnis und die einzusetzenden Mengen der Substanz werden durch die folgenden Angaben festgelegt:

- der vorläufige Schätzwert des Verteilungsköffizienten (siehe 1.6.1),

- die für das Analysenverfahren erforderliche Mindestmenge an Prüfsubstanz und

- die Begrenzung der Konzentration in jeder Phase auf maximal 0,01 Mol/l.

Es sind drei Prüfungen durchzuführen. Bei der ersten wird das berechnete Volumenverhältnis n-Oktanol/Wasser eingesetzt, bei der zweiten wird dieses Verhältnis halbiert, bei der dritten verdoppelt (z.B. 1:1, 1:2, 2:1).

1.6.2.1.3. Prüfsubstanz

Es wird eine Vorratslösung in mit Wasser vorgesättigtem n-Oktanol hergestellt. Die Konzentration dieser Vorratslösung soll vor deren Gebrauch zur Bestimmung des Verteilungsköffizienten exakt bestimmt werden. Diese Lösung soll so gelagert werden, daß ihre Stabilität gewährleistet ist.

1.6.2.2. Prüfbedingungen

Die Prüftemperatur sollte zwischen 20 und 25 C liegen und konstant ( 1 C) gehalten werden.

1.6.2.3. Meßverfahren

1.6.2.3.1. Einstellen des Verteilungsgleichgewichts

Für jede der Prüfbedingungen sollen zwei Prüfgefässe vorbereitet werden, die jeweils die erforderlichen, genau abgemessenen Mengen der beiden Lösungsmittel sowie die erforderliche Menge an Vorratslösung enthalten.

Die n-Oktanol-Phasen sollten volumetrisch bestimmt werden. Die Prüfgefässe sollten entweder mit einem geeigneten Schüttelapparat oder von Hand geschüttelt werden. Bei Verwendung eines Zentrifugenglases besteht ein empfohlenes Verfahren darin, das Glas rasch um 180 C um seine Querachse zu drehen, so daß eventuell eingeschlossene Luft durch beide Phasen aufsteigt. Erfahrungsgemäß reichen im allgemeinen 50 solcher Umdrehungen zur Einstellung des Verteilungsgleichgewichts aus. Zur Sicherheit werden 100 Umdrehungen in fünf Minuten empfohlen.

1.6.2.3.2. Phasentrennung

Zur Trennung der Phasen sollte die Mischung, sofern erforderlich, in einer Laborzentrifuge bei Raumtemperatur zentrifugiert werden. Wenn eine Zentrifuge ohne Thermostat benutzt wird, sollten die Zentrifugengläser vor der Analyse mindestens eine Stunde bei Prüftemperatur aufbewahrt werden, damit sich das Gleichgewicht einstellt.

1.6.2.4. Analyse

Zur Ermittlung des Verteilungsköffizienten müssen die Konzentrationen der Prüfsubstanz in beiden Phasen analysiert werden. Dies kann dadurch geschehen, daß von jeder der beiden Phasen aus jedem Glas und für jede Prüfbedingung ein aliquoter Teil entnommen und mit dem gewählten Verfahren analysiert wird. Die in den beiden Phasen vorhandene Gesamtmenge der Substanz ist zu berechnen und mit der eingesetzten Menge zu vergleichen.

Die Probenahme aus der wäßrigen Phase sollte so erfolgen, daß die Gefahr des Einschlusses von Spuren an n-Oktanol möglichst weitgehend vermindert wird: z.B. kann eine Glasspritze mit auswechselbarer Nadel zur Probenahme verwendet werden. Zuerst sollte die Spritze teilweise mit Luft gefuellt werden. Diese Luft sollte vorsichtig herausgedrückt werden, während die Nadel durch die n-Oktanolschicht hindurchgeführt wird. Ein ausreichendes Volumen an wäßriger Phase wird in die Spritze gezogen. Die Spritze wird schnell aus der Lösung entfernt und die Nadel abgenommen. Der Inhalt der Spritze kann dann als wäßrige Probe weiterverwendet werden. Die Konzentration in den beiden voneinander getrennten Phasen sollte am besten mit einem substanzspezifischen Verfahren ermittelt werden. Beispiele für möglicherweise geeignete Analysenverfahren sind:

- photometrische Verfahren,

- Gaschromatographie,

- Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie.

1.6.3. HPLC-Methode

1.6.3.1. Vorbereitung

Apparatur

Erforderlich ist ein mit einer pulsfreien Pumpe und einem geeigneten Detektor ausgestatter Flüssigkeitschromatograph. Dabei wird die Verwendung eines Einspritzventils mit Dosierschleife empfohlen. Die Leistung der HPLC-Säule kann durch das Vorhandensein polarer Gruppen in der stationären Phase ernsthaft beeinträchtigt werden. Deshalb sollten die stationären Phasen ein Minimmen an polaren Gruppen haben (11). Es können handelsübliche Mikroteilchenfuellungen für die Umkehrphasenchromatographie oder Fertigsäulen verwendet werden. Zwischen dem Dosiersystem und der Analysensäule kann eine Vorsäule angebracht werden.

Mobile Phase

Zur Zubereitung des Elutionsmittels werden für die HPLC-Methode ausreichend reines Methanol und Wasser verwendet; das Elutionsmittel wird vor seiner Verwendung entgast. Es sollte das Verfahren der isokratischen Elution angewendet werden. Dabei werden Methanol-/Wasser-Verhältnisse mit einem Mindestgehalt an Wasser von 25 % empfohlen. Im Normalfall ist eine Methanol-Wasser-Mischung im Volumenverhältnis 3:1 für die Eluierung von Verbindungen mit einem log P-Wert von 6 bei einer Elutionszeit von einer Stunde ausreichend (Durchflußrate: 1 ml/min). Für Verbindungen mit einem hohen log P-Wert kann eine Verkürzung der Elutionszeit (auch der der Referenzsubstanzen) durch Senkung der Polarität der mobilen Phase oder Kürzung der Säulenlänge erforderlich sein.

Stoffe mit einer sehr geringen Löslichkeit in n-Oktanol ergeben bei der HPLC-Methode häufig anormal niedriger log Pow-Werte; die Peaks dieser Stoffe begleiten mitunter die Lösungsmittelfront. Dies liegt wahrscheinlich daran, daß der Verteilungsprozeß zu langsam ist, um innerhalb der normalerweise für eine HPLC-Trennung benötigten Zeit den Gleichgewichtszustand zu erreichen. In solchen Fällen kann die Verminderung der Durchflußrate und/oder des Methanol-Wasser-Verhältnisses ein wirksames Verfahren sein, um zu einem zuverlässigen Wert zu gelangen.

Prüf- und Referenzsubstanz sollten in der mobilen Phase in ausreichender Konzentration lösbar sein, um nachgewiesen werden zu können. Nur in Ausnahmefällen dürfen in der Methanol-Wasser-Mischung Zusatzstoffe verwendet werden, da diese Zusatzstoffe die Eigenschaften der Säule verändern. Für Chromatogramme, die mit Zusatzstoffen erhalten wurden, ist der Einsatz einer weiteren Säule desselben Typs zwingend vorgeschrieben. Wenn die Methanol-Wasser-Mischung ungeeignet ist, können andere Mischungen aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser verwendet werden, so z.B. Ethanol-Wasser oder Acetonitril-Wasser.

Der pH-Wert des Lösungsmittels ist für ionische Verbindungen kritisch. Er sollte innerhalb des pH-Betriebsbereichs der Säule liegen, der sich im allgemeinen zwischen 2 und 8 bewegt. Die Anwendung eines Puffers ist ratsam. Dabei muß darauf geachtet werden, daß kein Salz ausfällt und es nicht zur Beschädigung der Säule kommt, was bei einer Reihe von Mischungen von organischer Phase und Puffer möglich ist. HPLC-Messungen mit an Siliziumdioxid gebundener stationärer Phase und einem pH-Wert über 8 sind nicht empfehlenswert, da die Verwendung einer alkalischen mobilen Phase zu einem rapiden Nachlassen der Leistung der Säule führen kann.

Referenz-/Prüfsubstanzen

Die Referenzsubstanzen sollten den höchstmöglichen Reinheitsgrad haben. Das für Prüf- oder Eichzwecke zu verwendende Substanzgemisch wird, wenn möglich, in der mobilen Phase gelöst.

Prüfbedingungen

Die Temperatur sollte im Verlauf der Messungen um nicht mehr als 2 K schwanken.

1.6.3.2. Messung

Berechnung der Totzeit to

Die Totzeit lässt sich entweder durch Verwendung einer homologen Reihe (z.B. n-Alkyl-Methyl-Ketone) oder durch nicht chromatographisch verzögerte organische Verbindungen (z.B. Thioharnstoff oder Formamid) bestimmen. Zur Berechnung der Totzeit to mit Hilfe einer homologen Reihe werden mindestens 7 Komponenten einer homologen Reihe eingespritzt und die jeweiligen Retentionszeiten gemessen. Die Retentionszeiten tr(nc + 1) werden in Abhängigkeit von tr(nc) aufgetragen und anschließend der Schnittpunkt a und die Steigung b der Regressionsgleichung:

tr(nc + 1) = a + b tr(nc)

bestimmt (nc = Anzahl der Kohlenstoffatome). Die Totzeit to ergibt sich dann aus

to = a / (1 b)

Eichkurve

Der nächste Schritt besteht in der Aufstellung einer Korrelationskurve log k/log P für geeignete Referenzsubstanzen. In der Praxis werden dazu zwischen 5 und 10 Standard-Referenzsubstanzen, deren log P-Wert in der Nähe des erwarteten Bereichs liegt, gleichzeitig eingespritzt und die Retentionszeiten am besten mit Hilfe eines mit dem Nachweissystem gekoppelten registrierenden Integrators bestimmt. Die Logarithmen der entsprechenden Kapazitätsfaktoren (log k) werden berechnet und gegen die mittels der Schüttelmethode bestimmten log P-Werte aufgezeichnet. Die Eichung wird in regelmässigen Abständen, mindestens einmal täglich, vorgenommen, so daß eventuelle Veränderungen in der Leistung der Säule berücksichtigt werden können.

Bestimmung des Kapazitätsfaktors der Prüfsubstanz

Die Prüfsubstanz wird in möglichst geringer Menge der mobilen Phase eingespritzt. Die Retentionszeit wird (doppelt) bestimmt zur Berechnung des Kapazitätsfaktors k. Aus der Korrelationskurve der Referenzsubstanzen kann der Verteilungsköffizient der Prüfsubstanz interpoliert werden. Bei sehr niedrigen und sehr hohen Verteilungsköffizienten ist eine Extrapolation erforderlich. In diesen Fällen ist besonders auf die Vertrauensgrenzen der Regressionsgeraden zu achten.

2. DATEN

Schüttelmethode

Die Zuverlässigkeit der ermittelten P-Werte kann durch Vergleich der Mittelwerte der Doppelbestimmungen mit dem Gesamtmittelwert geprüft werden.

3. ABSCHLUSSBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben

- genaue Spezifizierung der Substanz (Identität und Verunreinigungen);

- wenn die Methoden nicht anwendbar sind (z.B. bei oberflächenaktivem Material), sollte ein errechneter Wert oder ein Schätzwert auf der Grundlage der einzelnen n-Oktanol- und Wasserlöslichkeiten vorgelegt werden;

- alle für die Auswertung der Ergebnisse sachdienlichen Informationen und Bemerkungen, insbesondere in bezug auf Verunreinigungen und den Aggregatzustand des Stoffes.

für die Schüttelmethode:

- das Ergebnis der Abschätzung (wenn vorhanden);

- die Prüftemperatur;

- Angaben über die zur Konzentrationsbestimmung verwendeten Analysenverfahren;

- die Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit (wenn zutreffend);

- die in beiden Phasen bei jeder Bestimmung gemessenen Konzentrationen (d.h. insgesamt 12 Konzentrationen sollten angegeben werden);

- die Einwaage an Prüfsubstanz, das Volumen jeder Phase in jedem Prüfgefäß und die berechnete Gesamtmenge an Prüfsubstanz, die in jeder Phase nach Erreichen des Gleichgewichts enthalten ist;

- die berechneten Werte des Verteilungsköffizienten (P) für jede Prüfung, der Mittelwert für jede Prüfbedingung und der Mittelwert aus allen Prüfungen sind anzugeben. Hinweise auf eine Konzentrationsabhängigkeit des Verteilungsköffizienten sollten im Bericht vermerkt werden;

- die Standardabweichung der einzelnen P-Werte vom Mittelwert sollte angegeben werden;

- der Mittelwert P aus allen Prüfungen sollte auch als Zehnerlogarithmus angegeben werden;

- der mit einem Berechnungsverfahren ermittelte theoretische Pow-Wert sollte angegeben werden, wenn er bestimmt wurde oder wenn der Meßwert > 104 ist;

- der pH-Wert des verwendeten Wassers und der wäßrigen Phase während des Versuchs;

- bei Verwendung von Pufferlösungen: Begründung der Verwendung von Pufferlösungen anstelle von Wasser, Zusammensetzung, Konzentration und pH-Wert der Pufferlösungen, pH-Wert der wäßrigen Phase vor und nach dem Versuch.

für die HPLC-Methode:

- das Ergebnis der Abschätzung (wenn vorhanden);

- Prüf- und Referenzsubstanzen und deren Reinheitsgrad;

- Temperaturbereich der Prüfungen;

- pH-Wert, bei dem die Prüfungen vorgenommen wurden;

- nähere Angaben zur Analysen- und zur Vorsäule, zur mobilen Phase sowie zum Nachweisverfahren;

- Retentionswerte und log P-Werte aus der Literatur für die bei der Eichung verwendeten Referenzsubstanzen;

- nähere Angaben zur Anpassung der Regressionsgeraden (log k/log P);

- durchschnittliche Retentionswerte und interpolierter log P-Wert für die Prüfsubstanz;

- Beschreibung der Ausrüstungen und der Betriebsbedingungen;

- Elutionsprofile;

- Mengen der auf die Säule gegebenen Prüf- und Referenzsubstanzen;

- Totzeit und entsprechendes Meßverfahren.

LITERATUR

(1) ÖCD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) C. Hansch und A.J. Leo, Substitution Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) - Erhältlich bei Pomona College Medicinal Chemistry Project, 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

(4) L. Renberg, G. Sundström und K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683.

(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt und R. Fürer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219.

(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.

(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatog., 1982, vol. 247, 1.

(8) J.E. Haky und A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675.

(9) S. Fujisawa und E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787.

(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in: Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumspraxis (herausgegeben von E. Müller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.

(11) R.F. Rekker und H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479.

(12) A. Leo, C. Hansch und D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.

(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use - Determination of partition coefficient - Flask shaking method.

(15) C.V. Eadsforth und P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.

(16) A. Leo, C. Hansch und D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani und E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.

(18) W.B. Neely, D.R. Branson und G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113.

(19) D.S. Brown und E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382.

(20) J.K. Seydel und K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979.

(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984.

(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978.

(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy und P.J. Taylor, J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

Anlage 1

Berechnungs-/Schätzverfahren

EINLEITUNG

Eine allgemeine Einführung in die Berechnungsverfahren, Daten und Beispiele werden im Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) gegeben.

Berechnete Pow-Werte können verwendet werden:

- zur Entscheidung darüber, welche der Versuchsmethoden die geeignete ist (Bereich der Schüttelmethode: log Pow: 2 bis 4; Bereich der HPLC-Methode: log Pow: 0 bis 6);

- zur Wahl der geeigneten Prüfbedingungen (z.B. Referenzsubstanzen für die HPLC-Verfahren, Volumenverhältnis n-Oktanol/Wasser für die Schüttelmethode);

- zur laborinternen Überprüfung eventueller Versuchsfehler;

- zur Pow-Bestimmung in solchen Fällen, wo die Prüfmethoden aus technischen Gründen nicht anwendbar sind.

ABSCHÄTZVERFAHREN

Vorläufige Abschätzung des Verteilungsköffizienten

Der Wert des Verteilungsköffizienten kann durch Verwendung der Löslichkeitswerte der Prüfsubstanz in den reinen Lösungsmitteln abgeschätzt werden:

Dafür gilt:

PSchätzwert = Sättigung cn-OktanolSättigung cWasser

BERECHNUNGSVERFAHREN

Prinzip der Berechnungsverfahren

Sämtliche Berechnungsverfahren beruhen auf der formalen Aufspaltung des Moleküls in geeignete Substrukturen, für die zuverlässige log Pow-Inkremente bekannt sind. Der log Pow-Wert des gesamten Moleküls wird danach als Summe seiner entsprechenden Teilwerte plus Summe der Korrekturglieder für intramolekulare Wechselwirkungen berechnet.

Aufstellungen über die Konstanten von Substrukturen und den Korrekturgliedern liegen vor (b)(c)(d)(e). Einige davon werden regelmässig aktualisiert (b).

Qualitätskriterien

Im allgemeinen nimmt die Zuverlässigkeit des Berechnungverfahrens in dem Masse ab, in dem die Komplexität der Prüfsubstanz zunimmt. Bei einfachen Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht und einer oder zwei funktioneller Gruppen ist mit einer Abweichung von 0,1 bis 0,3 log Pow-Einheiten von den Ergebnissen der verschiedenen Fragmentmethoden gegenüber dem Meßwert zu rechnen. Bei komplexeren Substanzen kann die Fehlerspanne grösser sein. Dies hängt von der Zuverlässigkeit und der Verfügbarkeit der Konstanten für die Substrukturen sowie von der Fähigkeit der Erkennung intramolekularer Wechselwirkungen (z.B. Wasserstoffbindungen) und der richtigen Anwendung der Korrekturglieder ab (was mit dem Computer-Programm CLOGP-3 ein geringeres Problem ist) (b). Bei ionischen Substanzen ist die richtige Berücksichtigung der Ladung oder des Ionisierungsgrades wichtig.

Berechnungsverfahren

Hansch'vche -Methode

Die ursprünglich für hydrophobe Substitünten verwendete Konstante , eingeführt von Fujita et al. (f), wird wie folgt definiert:

x = log Pow (PhX)log Pow (PhH)

wobei Pow (PhX) der Verteilungsköffizient eines aromatischen Abkömmlings und Pow (PhH) derjenige der Ausgangssubstanz ist

(z.B. Cl = log Pow (C6H5Cl) log Pow (C6H6) = 2,84 2,13 = 0,71).

Nach seiner Definition ist die -Methode vorwiegend bei der aromatischen Substitution anwendbar. Die -Werte liegen für eine grosse Anzahl von Substitünten tabelliert vor (b)(c)(d). Sie werden für die Berechnung der log Pow-Werte für aromatische Moleküle oder Substrukturen verwendet.

Rekker-Methode

Nach Rekker (g) wird der log Pow-Wert wie folgt berechnet:

log Pow = Siai fi + Sj (Wechselwirkungsglieder)

wobei fi die verschiedenen Konstanten der Substrukturen und ai die Häufigkeit ihres Vorkommens in der Prüfsubstanz darstellen. Die Korrekturglieder lassen sich als ein ganzes Vielfaches einer einzigen Konstante Cm (der sogenannten "magischen Konstante") angeben. Die Substruktur-Konstanten fi und Cm wurden aus einer Liste von 1 054 experimentell ermittelten Pow-Werten (825 Verbindungen) mit Hilfe der mehrfachen Regressionsanalyse bestimmt (c)(h). Die Bestimmung der Glieder für die Wechselwirkungen erfolgt auf der Grundlage der in der Literatur angegebenen Regeln (e)(h)(i).

Hansch-Leo-Methode

Nach Hansch und Leo (c) wird der log Pow-Wert aus der Beziehung

log Pow = Siai fi + Sj bj Fj

errechnet, wobei fi die verschiedenen Konstanten der Substrukturen, Fj die Korrekturglieder und ai, bj die entsprechenden Vorkommenshäufigkeiten sind. Eine Liste der Substrukturwerte für einzelne Atome und Gruppen, abgeleitet aus experimentell bestimmten Pow-Werten, und eine Liste der Korrekturglieder Fj (sogenannte "Faktoren") wurden durch die Trial-and-error-Methode erhalten. Die Korrekturglieder sind in mehrere unterschiedliche Kategorien eingeordnet worden (a)(c). Es ist relativ kompliziert und zeitraubend, alle Regeln und Korrekturglieder zu berücksichtigen. Software-Pakete sind entwickelt worden (b).

Kombinierte Methode

Die Berechnung der log Pow-Werte komplexer Substanzen kann beträchtlich verbessert werden, wenn das Molekül in grössere Substrukturen zerlegt wird, für die zuverlässige log Pow-Werte vorliegen, sei es aus Tabellen (b)(c), sei es aus eigenen Messungen. Solche Substrukturen (z.B. Heterozyklen, Anthrakinon, Azobenzen) können dann mit den Hansch'schen -Werten oder mit den Substruktur-Konstanten nach Rekker oder Leo kombiniert werden.

Anmerkungen

i) Die Berechnungsmethoden können auf teilweise oder vollständig ionisierte Substanzen nur dann angewendet werden, wenn die erforderlichen Korrekturfaktoren berücksichtigt werden können.

ii) Wenn von intramolekularen Wasserstoffbindungen ausgegangen werden kann, müssen die entsprechenden Korrekturglieder (etwa + 0,6 bis + 1,0 log Pow-Einheiten) addiert werden (a). Hinweise auf das Vorliegen solcher Bindungen lassen sich aus Stereo-Modellen oder spektroskopischen Daten der Substanz gewinnen.

iii) Wenn mehrere tautomere Formen möglich sind, sollte als Berechnungsgrundlage die wahrscheinlichste Form verwendet werden.

iv) Die Überarbeitungen der Listen der Substrukturkonstanten sollten sorgfältig verfolgt werden.

Abschlußbericht

Bei der Verwendung der Berechnungs-/Abschätzmethoden sollte der Prüfbericht, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Beschreibung der Substanz (Gemisch, Verunreinigungen usw.);

- Hinweis auf eine eventuell vorliegende intramolekulare Wasserstoffbindung, Dissoziation, Ladung oder irgendwelche anderen ungewöhnlichen Effekte (z.B. Tautomerie);

- Beschreibung des Berechnungsverfahrens;

- Identität oder Bereitstellung der Datenbasis;

- Besonderheiten bei der Wahl der Substrukturen;

- ausführliche Dokumentation zur Berechnung.

LITERATUR

(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl und D.H. Rosenblatt (Hrsg.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C. Hansch und A.J. Leo, Substitünt Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo und C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev. 1971, vol. 71, 525.

(e) R.F. Rekker und H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem.- Chim. Ther., 1979, vol. 14, 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa und C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

(g) R.F. Rekker, The Hydrophopic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, vol. 1, Elsevier, New York, 1977.

(h) C.V. Eadsforth und P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.

(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Anlage 2

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

A.9. FLAMMPUNKT

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Es ist sinnvoll, vor Durchführung einer Flammpunktbestimmung Vorinformationen über die Entzuendlichkeit der Prüfsubstanz zu haben. Das Prüfverfahren ist auf fluessige Substanzen anwendbar, deren Dämpfe durch Zuendquellen entflammt werden können. Die in diesem Text beschriebenen Prüfmethoden ergeben nur für diejenigen Flammpunktbereiche, die bei den einzelnen Verfahren angegeben werden, zuverlässige Werte.

Bei der Wahl der anzuwendenden Methode sollten eventuelle chemische Reaktionen zwischen der Substanz und dem Probentiegel berücksichtigt werden.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Der Flammpunkt ist die niedrigste Temperatur, bezogen auf einen Druck von 101,325 kPa, bei der sich unter den bei der Prüfmethode angegebenen Bedingungen aus einer Flüssigkeit Dämpfe in einer solchen Menge entwickeln, daß sich im Tiegel ein durch Fremdzuendung entflammbares Dampf-Luft-Gemisch bildet.

Einheiten: Ct = T - 273,15(t in C und T in K)

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Referenzsubstanzen müssen nicht in allen Fällen verwendet werden, in denen eine neue Prüfsubstanz untersucht wird. Die Referenzsubstanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen, ob bei der Prüftemperatur eine Entzuendung stattfinden kann oder nicht.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Die Prüfsubstanz wird in einen Tiegel gefuellt und nach dem bei der jeweiligen Prüfmethode angegebenen Verfahren auf die Prüftemperatur erwärmt oder abgekühlt. Zuendversuche werden ausgeführt, um festzustellen, ob bei der Prüftemperatur eine Zuendung stattgefunden hat oder nicht.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

1.5.1. Wiederholbarkeit

Die Wiederholbarkeit hängt ab vom Flammpunktbereich und der angewandten Prüfmethode; max. 2 C.

1.5.2. Empfindlichkeit

Die Empfindlichkeit hängt von der angewandten Prüfmethode ab.

1.5.3. Anwendbarkeit

Die Anwendbarkeit einiger Flammpunktprüfmethoden ist auf bestimmte Flammpunktbereiche beschränkt und hängt von substanzspezifischen Eigenschaften ab (z. B. hohe Viskosität).

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitungen

Die zu prüfende Substanz wird in den jeweiligen Prüftiegel (s. 1.6.3.1. und/oder 1.6.3.2.) eingefuellt.

Aus Sicherheitsgründen wird empfohlen, für energiereiche oder toxische Substanzen ein Verfahren mit einer kleinen Probengrösse (etwa 2 cm3) anzuwenden.

1.6.2. Versuchsbedingungen

Soweit dies aus Sicherheitsgründen möglich ist, sollte das Prüfgerät vor Zugluft geschützt aufgestellt werden.

1.6.3. Versuchsausführung

1.6.3.1. Gleichgewichtsmethode

Siehe dazu: ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.

1.6.3.2. Nicht-Gleichgewichtsmethode

Gerät nach Abel:

Siehe dazu: BS 2000 Teil 170, NF M07-011, NF T66-009.

Gerät nach Abel-Pensky:

Siehe dazu: EN 57, DIN 51755 Teil 1 (für Temperaturen von 5 C bis 65 C), DIN 51755 Teil 2 (für Temperaturen unter 5 C), NF M07-036.

Gerät nach Tag:

Siehe dazu: ASTM D 56.

Gerät nach Pensky-Martens:

Siehe dazu: ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Anmerkungen:

Wird mit einer Nicht-Gleichgewichtsmethode wie in 1.6.3.2. ein Flammpunkt von (0 2) C, (21 2) C oder (55 2) C ermittelt, sollte das Prüfergebnis mit dem gleichen Gerät, jedoch unter Verwendung einer Gleichgewichtsmethode, bestätigt werden.

Für eine Anmeldung dürfen nur diejenigen Methoden angewandt werden, bei denen der Zahlenwert des Flammpunktes bestimmt wird.

Zur Bestimmung des Flammpunktes viskoser Flüssigkeiten (Farben, Klebstoffe und ähnliches), die Lösemittel enthalten, dürfen nur solche Prüfgeräte und Prüfmethoden angewandt werden, die zur Bestimmung des Flammpunktes viskoser Flüssigkeiten geeignet sind.

Siehe dazu: ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 Teil 1.

2. DATEN

3. BERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen);

- die angewandte Prüfmethode sowie eventuelle Abweichungen davon sollen angegeben werden;

- die Ergebnisse sowie alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der Ergebnisse von Bedeutung sind.

4. LITERATUR

Keine.

A.10. ENTZUENDLICHKEIT (FESTE STOFFE)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Es ist zweckdienlich, vor Ausführung der Prüfung Informationen über mögliche explosive Eigenschaften der Prüfsubstanz einzuholen.

Diese Methode kann nur bei pulverförmigen, körnigen oder pastenförmigen Substanzen angewendet werden.

Um nicht alle Stoffe zu erfassen, die entzuendet werden können, sondern nur solche, die schnell brennen oder deren Brennverhalten besonders gefährlich ist, sollen nur diejenigen Stoffe als leichtentzuendlich eingestuft werden, deren Abbrandgeschwindigkeit einen bestimmten Grenzwert überschreitet.

Es kann besonders gefährlich sein, wenn sich das Glühen in einem Metallpulver ausbreitet, weil glühende Metallpulver schwer zu löschen sind. Metallpulver sind als leichtentzuendlich zu beurteilen, wenn sie über die gesamte Länge der Schüttung innerhalb einer festgelegten Zeit durchglühen.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Die Abbrandzeit wird in Sekunden ausgedrückt.

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Nicht spezifiziert.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Die Substanz wird zu einem durchgehenden Strang oder einer Schüttung von etwa 250 mm Länge geformt; danach wird ein Vorversuch vorgenommen, um zu prüfen, ob es bei Entzuendung mit einer Gasflamme zu einer Ausbreitung des Brandes mit Flammen oder durch Glimmen kommt. Wenn es innerhalb einer festgelegten Zeit zu einer Ausbreitung über 200 mm der Schüttung kommt, wird ein vollständiges Testprogramm zur Bestimmung der Brenngeschwindigkeit durchgeführt.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Nicht genannt.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorversuch

Die Substanz wird auf einer nichtbrennbaren und nichtporösen Platte mit geringer Wärmeleitfähigkeit zu einem durchgehenden Strang oder einer Schüttung von 250 mm Länge, 20 mm Breite und 10 mm Höhe geformt. Danach wird die heisse Flamme eines Gasbrenners (Mindestdurchmesser 5 mm) auf ein Ende der Schüttung gerichtet, bis sich das Pulver entzuendet, maximal 2 Minuten (5 Minuten für Pulver von Metallen oder Metallegierungen). Dabei ist festzustellen, ob sich der Brand innerhalb des Prüfzeitraumes von 4 Minuten (40 Minuten bei Metallpulvern) über eine Länge von 200 mm der Schüttung ausbreitet. Wenn sich die Substanz nicht entzuendet und sich keine Verbrennung mit einer Flamme oder mit Glimmen innerhalb von 4 Minuten (bzw. 40 Minuten) über eine Länge von 200 mm der

Schüttung ausbreitet, ist die Substanz nicht als leichtentzuendlich zu beurteilen, und es ist keine weitere Prüfung erforderlich. Wenn sich der Brand in der Substanz in weniger als 4 Minuten (bzw. in weniger als 40 Minuten für Metallpulver) über eine Länge von 200 mm der Schüttung ausbreitet, ist das nachstehend beschriebene Verfahren (Punkt 1.6.2 und folgende) auszuführen.

1.6.2. Prüfung der Brenngeschwindigkeit

1.6.2.1. Vorbereitung

Pulverförmige oder körnige Substanzen werden locker in eine Form von 250 mm Länge und einem dreieckigen Querschnitt mit einer inneren Höhe von 10 mm und einer Breite von 20 mm gefuellt. Die Form wird an beiden Längsseiten von zwei Metallblechen begrenzt, die die dreieckige Form um 2 mm überragen (siehe Abbildung). Die gefuellte Form wird dreimal aus einer Höhe von 2 cm auf eine feste Unterlage fallen gelassen. Falls nötig, wird die Form danach aufgefuellt.

Dann werden die seitlichen Begrenzungen entfernt, und die überschüssige Substanzmenge wird abgetrennt. Schließlich wird eine nichtbrennbare und nichtporöse Platte mit geringer Wärmeleitfähigkeit auf die Form gelegt, das Ganze um 180 gedreht und die Form entfernt.

Pastenförmige Substanzen werden in Form eines Stranges von 250 mm Länge und mit einem Querschnitt von etwa 1 cm2 auf eine nichtbrennbare und nichtporöse Platte mit geringer Wärmeleitfähigkeit aufgebracht.

1.6.2.2. Versuchsbedingungen

Hygroskopische Prüfsubstanzen sollen so schnell wie möglich nach der Entnahme aus dem Behälter geprüft werden.

1.6.2.3. Versuchsausführung

Die Schüttung wird quer zur Zugrichtung in einem Abzug angeordnet.

Die Absauggeschwindigkeit muß so hoch sein, daß Rauch nicht in das Labor dringen kann; sie soll auch während des Versuchs nicht verändert werden. Um die Versuchsanordnung herum ist ein Windschutz aufzustellen.

Zum Anzuenden der Schüttung an einem Ende wird die heisse Flamme eines Gasbrenners (Mindestdurchmesser 5 mm) verwendet. Nach einem Abbrand über eine Länge von 80 mm der Schüttung ist die Abbrandzeit über die folgenden 100 mm zu messen.

Der Versuch ist sechsmal auszuführen, wenn nicht vorher ein positives Ergebnis beobachtet wird. Für jeden Versuch ist eine saubere, kalte Platte zu verwenden.

2. DATEN

Die Abbrandzeit aus dem Vorversuch (1.6.1) und die kürzeste Abbrandzeit aus sechs Versuchen (1.6.2.3) sind maßgebend für die Beurteilung.

3. BERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- eine genaue Spezifizierung der Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen);

- eine Beschreibung der Prüfsubstanz, deren Aggregatzustand, einschl. Feuchtegehalt;

- die Ergebnisse des Vorversuchs und der Prüfung der Brenngeschwindigkeit (wenn durchgeführt);

- alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der Ergebnisse von Bedeutung sind.

3.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE

Pulverförmige, körnige oder pastenförmige Prüfsubstanzen werden als leichtentzuendlich beurteilt, wenn die Abbrandzeit bei einem der unter 1.6.2 beschriebenen Versuche kürzer ist als 45 Sekunden Pulver von Metallen oder Metallegierungen werden als leichtentzuendlich beurteilt, wenn sie entzuendet werden können und sich die Flamme oder die Reaktionszone innerhalb von 10 Minuten oder darunter über die gesamte Probe ausbreitet.

4. LITERATUR

(1) NF T 20-042 (SEPT. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

Anlage

Abbildung

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Form und Zubehör zur Herstellung der Schüttung (alle Massangaben in mm)

A.11 ENTZUENDLICHKEIT (GASE)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Mit dieser Methode lässt sich bestimmen, ob Gase im Gemisch mit Luft bei atmosphärischem Druck und Raumtemperatur (etwa 20 C) einen Explosionsbereich haben. Gemische mit steigender Konzentration des zu prüfenden Gases mit Luft werden einem elektrischen Funken ausgesetzt, und man beobachtet, ob eine Entzuendung erfolgt.

1.2. DEFINITION UND EINHEITEN

Der Explosionsbereich ist der Konzentrationsbereich zwischen der unteren und der oberen Explosionsgrenze. Die untere und die obere Explosionsgrenze bezeichnen die beiden Grenzwerte des Brenngasgehaltes im Brenngas/Luft-Gemisch, bei denen eine selbständige Flammenausbreitung von der Zuendquelle her gerade nicht mehr auftritt.

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Nicht spezifiziert.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Der Gasanteil im Gas/Luft-Gemisch wird stufenweise erhöht und das Gemisch jeweils einem elektrischen Funken ausgesetzt.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Nicht spezifiziert.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Gerät

Das Versuchsgefäß ist ein aufrecht stehender Glaszylinder mit einem inneren Durchmesser von mindestens 50 mm und einer Mindesthöhe von 300 mm. Die Zuendelektroden befinden sich 60 mm über dem Boden des Zylinders und haben einen Abstand von 3 mm bis 5 mm voneinander. Der Zylinder ist mit einer Druckentlastungsöffnung versehen. Das Gerät ist mit einem Schutzschirm versehen, um Explosionsschäden zu vermeiden.

Ein Induktionsfunken von 0,5 s Dauer, der mittels eines Hochspannungstransformators von 10 bis 15 kV Sekundärspannung (maximale Leistungsaufnahme: 300 W) erzeugt wird, dient als Zuendquelle. Ein Beispiel eines geeigneten Gerätes ist in (2) beschrieben.

1.6.2. Versuchsbedingungen

Der Versuch muß bei Raumtemperatur (etwa 20 C) ausgeführt werden.

1.6.3. Versuchsausführung

Mit Hilfe von Dosierpumpen wird ein Gas/Luft-Gemisch bekannter Konzentration in den Glaszylinder geleitet. Danach wird mit dem Induktionsfunken gezuendet und beobachtet, ob sich eine Flamme von der Zuendquelle ablöst und selbständig ausbreitet oder nicht. Der Gasanteil wird beginnend bei 1 % (Volumenanteil) stufenweise um 1 % erhöht, bis eine wie oben beschriebene Entzuendung erfolgt.

Wenn die chemische Struktur auf ein nicht entzuendbares Gas schließen lässt und die Zusammensetzung des stöchiometrischen Gemisches mit Luft errechnet werden kann, dann brauchen nur Gemische in einem Bereich zwischen 10 % unterhalb und 10 % oberhalb der stöchiometrischen Zusammensetzung in 1 %-Stufen geprüft zu werden.

2. DATEN

Das Auftreten der Flammenablösung ist die einzige relevante Information zur Bestimmung dieser Eigenschaft.

3. BERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen);

- eine Beschreibung des benutzten Gerätes (mit Abmessungen);

- die Temperatur, bei der der Versuch durchgeführt wurde;

- die geprüften Konzentrationen und die erhaltenen Ergebnisse;

- das Versuchsergebnis: nicht entzuendbares oder leichtentzuendliches Gas;

- wenn das Ergebnis "nicht entzuendbar" lautet, ist der Konzentrationsbereich, über den es in 1 %-Schritten geprüft wurde, anzugeben;

- alle Informationen und Bemerkungen, die für die Interpretation der Ergebnisse von Bedeutung sind.

4. LITERATUR

(1) NF T 20-041 (SEPT. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.

(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. "Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen". Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, 126/127.

A.12 ENTZUENDLICHKEIT (Berührung mit Wasser)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Diese Prüfmethode kann angewendet werden, um festzustellen, ob die Reaktion eines Stoffes mit Wasser oder feuchter Luft zur Entwicklung gefährlicher Mengen von leichtentzuendlichen Gasen führt.

Das Verfahren kann sowohl für feste als auch für fluessige Stoffe angewendet werden. Dieses Verfahren gilt jedoch nicht für Stoffe, die sich bei Berührung mit Luft selbst entzuenden.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Leichtentzuendlich: Stoffe, die bei Berührung mit Wasser oder feuchter Luft leichtentzuendliche Gase in gefährlichen Mengen (mindestens 1 l/kg.h) entwickeln.

1.3. PRINZIP DER METHODE

Die Prüfsubstanz wird in der nachfolgend beschriebenen Reihenfolge geprüft; erfolgt auf irgendeiner Stufe eine Entzuendung, so ist keine weitere Prüfung mehr notwendig. Wenn bekannt ist, daß die Substanz bei Berührung mit Wasser keine heftige Reaktion zeigt, kann man zu Stufe 4 übergehen (1.3.4.).

1.3.1. Stufe 1

Die Prüfsubstanz wird in eine Schale gegeben, die destilliertes Wasser mit einer Temperatur von 20 C enthält; dabei wird festgestellt, ob sich das hierbei entwickelte Gas entzuendet oder nicht.

1.3.2. Stufe 2

Die Prüfsubstanz wird auf ein Filterpapier gegeben, das auf der Oberfläche des Wassers einer mit destilliertem Wasser von 20 C gefuellten Schale schwimmt; dabei wird festgestellt, ob sich das entwickelte Gas entzuendet oder nicht. Das Filterpapier dient nur dazu, die Substanz an der betreffenden Stelle zu halten, wodurch die Möglichkeit einer Entzuendung erhöht wird.

1.3.3. Stufe 3

Mit der Prüfsubstanz wird eine kleine Schüttung von etwa 2 cm Höhe und 3 cm Durchmesser hergestellt. Es werden einige Tropfen Wasser auf diese Schüttung gegeben, und es wird festgestellt, ob sich das entwickelte Gas entzuendet oder nicht.

1.3.4. Stufe 4

Die Prüfsubstanz wird mit destilliertem Wasser (20 C) versetzt, und die entwickelte Gasmenge wird über einen Zeitraum von 7 Stunden in Abständen von je einer Stunde gemessen. Ist die Gasentwicklung ungleichmässig oder nimmt sie nach sieben Stunden noch zu, so ist der Versuchszeitraum bis zu einer Dauer von fünf Tagen zu verlängern. Die Prüfung kann abgebrochen werden, wenn die Gasentwicklungsrate zu irgendeinem Zeitpunkt 1 l/kg.h übersteigt.

1.4. REFERENZSUBSTANZEN

Nicht spezifiziert.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine Angabe.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Stufe 1

1.6.1.1. Versuchsbedingungen

Der Versuch wird bei Raumtemperatur (etwa 20 C) ausgeführt.

1.6.1.2. Versuchsausführung

Eine geringe Menge (etwa 2 mm Durchmesser) der Prüfsubstanz wird in eine Schale mit destilliertem Wasser gegeben. Es wird notiert, (i) ob sich Gas entwickelt und (ii) ob sich das Gas entzuendet. Entzuendet sich das Gas, so braucht die Substanz nicht weiter geprüft zu werden, da sie als gefährlich zu betrachten ist.

1.6.2. Stufe 2

1.6.2.1. Gerät

Ein Filterpapier wird flach auf die Oberfläche des in ein geeignetes Gefäß gefuellten destillierten Wassers gelegt; als Gefäß kann z.B. eine Abdampfschale mit ca. 100 mm Durchmesser dienen.

1.6.2.2. Versuchsbedingungen

Der Versuch wird bei Raumtemperatur (etwa 20 C) durchgeführt.

1.6.2.3. Versuchsausführung

Eine geringe Menge (etwa 2 mm Durchmesser) der Prüfsubstanz wird mitten auf das Filterpapier gelegt. Es wird notiert, (i) ob sich Gas entwickelt und (ii) ob sich das Gas entzuendet. Entzuendet sich das Gas, so braucht die Substanz nicht weiter geprüft zu werden, da sie als gefährlich zu betrachten ist.

1.6.3. Stufe 3

1.6.3.1. Versuchsbedingungen

Der Versuch wird bei Raumtemperatur (etwa 20 C) durchgeführt.

1.6.3.2. Versuchsausführung

Mit der Prüfsubstanz wird eine kleine Schüttung von etwa 2 cm Höhe und 3 cm Durchmesser mit einer Vertiefung an der Spitze hergestellt. Man gießt einige Tropfen Wasser in die Vertiefung und notiert, (i) ob sich Gas entwickelt und (ii) ob sich das Gas entzuendet. Entzuendet sich das Gas, so braucht die Substanz nicht weiter geprüft zu werden, da sie als gefährlich zu betrachten ist.

1.6.4. Stufe 4

1.6.4.1. Gerät

Die Apparatur wird gemäß der Abbildung aufgebaut.

1.6.4.2. Versuchsbedingungen

Man stellt fest, ob sich in dem Behälter mit der Prüfsubstanz Pulver mit einer Korngrösse von ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Apparatur

A.13 PYROPHORE EIGENSCHAFTEN VON FESTEN UND FLÜSSIGEN STOFFEN

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Das Prüfverfahren ist anwendbar auf feste und fluessige Stoffe, die sich in kleinen Mengen nach kurzer Zeit an der Luft bei Raumtemperatur (etwa 20 C) selbst entzuenden.

Dieses Verfahren gilt nicht für Stoffe, die sich bei Raumtemperatur oder höheren Temperaturen erst nach Stunden oder Tagen selbst entzuenden.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Substanzen werden als pyrophor betrachtet, wenn sie sich unter den in 1.6. beschriebenen Bedingungen selbst entzuenden oder ein Verkohlung hervorrufen.

Nicht-pyrophore Flüssigkeiten sind im Hinblick auf ihre Selbstentzuendlichkeit nach Methode A.15 (Zuendtemperatur von Flüssigkeiten und Gasen) zu prüfen.

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Nicht spezifiziert.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Die Prüfsubstanz - fest oder fluessig - wird auf eine inerte Trägersubstanz gegeben und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit der Luft in Berührung gebracht. Wenn sich fluessige Stoffe nicht entzuenden, werden sie auf ein Filterpapier gegossen und bei Raumtemperatur (etwa 20 C) fünf Minuten lang der Luft ausgesetzt. Wenn ein fester oder fluessiger Stoff sich entzuendet oder ein fluessiger Stoff ein Filterpapier entzuendet oder verkohlt, dann wird die Substanz als pyrophor beurteilt.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Wiederholbarkeit: Aus sicherheitstechnischen Gründen genügt ein einziges positives Ergebnis, um die Substanz als pyrophor zu beurteilen.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Gerät

Eine Porzellanschale mit einem Durchmesser von etwa 10 cm wird bei Raumtemperatur (etwa 20 C) etwa 5 mm hoch mit Diatomeenerde gefuellt.

Bemerkung:

Diatomeenerde oder irgendein anderer, allgemein verfügbarer ähnlicher inerter Stoff soll repräsentativ für Erde sein, mit der bei einem Unfall ausgelaufene Stoffe in Berührung kommen können.

Ein trockenes Filterpapier wird für die Prüfung von solchen Flüssigkeiten benötigt, die sich auf der inerten Trägersubstanz an der Luft nicht entzuenden.

1.6.2. Versuchsausführung

a) Pulverförmige feste Stoffe

1 bis 2 cm3 der zu prüfenden pulverförmigen Substanz werden aus etwa 1 m Höhe auf eine nicht brennbare Unterlage geschüttet, und es wird beobachtet, ob sich die Substanz beim Fallen oder innerhalb von 5 Minuten nach Ablagerung entzuendet.

Wenn es nicht zu einer Entzuendung kommt, wird der Versuch sechsmal ausgeführt.

b) Flüssigkeiten

Etwa 5 cm3 der zu prüfenden Flüssigkeit werden in die vorbereitete Porzellanschale gegossen, und es wird beobachtet, ob sich die Prüfsubstanz innerhalb von fünf Minuten entzuendet.

Wenn es bei den sechs Versuchen nicht zu einer Entzuendung kommt, sind folgende Prüfungen durchzuführen:

Eine Probenmenge von 0,5 ml wird aus einer Spritze auf ein eingerissenes Filterpapier gegeben, und es wird beobachtet, ob es innerhalb von fünf Minuten nach Zugeben der Flüssigkeit zu einer Entzuendung oder zur Verkohlung des Filterpapiers kommt. Wenn es nicht zu einer Entzuendung oder zur Verkohlung des Filterpapiers kommt, wird der Versuch dreimal ausgeführt.

2. DATEN

2.1. FOLGERUNG AUS DEN ERGEBNISSEN

Die Prüfungen können abgebrochen werden, sobald einer der Versuche ein positives Ergebnis zeigt.

2.2. AUSWERTUNG

Wenn sich die Substanz innerhalb von fünf Minuten nach dem Aufbringen auf eine inerte Trägersubstanz bei Berührung mit Luft entzuendet oder wenn eine Flüssigkeit innerhalb von fünf Minuten nach dem Aufbringen an der Luft das Filterpapier entzuendet oder verkohlt, dann wird sie als pyrophor beurteilt.

3. BERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen);

- die Versuchsergebnisse;

- alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der Ergebnisse von Bedeutung sind.

4. LITERATUR

(1) NF T 20-039 (SEPT. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14. EXPLOSIONSGEFAHR

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Die Methode stellt ein Prüfschema dar zur Feststellung, ob feste oder pastenförmige Stoffe bei Flammenzuendung (thermische Empfindlichkeit) oder bei Einwirkung von Schlag oder Reibung (mechanische Empfindlichkeit) und ob Flüssigkeiten bei Flammenzuendung oder bei Einwirkung von Schlag eine Explosionsgefahr darstellen.

Die Methode besteht aus drei Teilen:

a) Prüfung der thermischen Empfindlichkeit (1);

b) Prüfung der mechanischen Empfindlichkeit bei Schlagbeanspruchung (1);

c) Prüfung der mechanischen Empfindlichkeit bei Reibbeanspruchung (1).

Die Methode liefert Ergebnisse, mit denen die Möglichkeit der Auslösung einer Explosion bei Einwirkung bestimmter, nicht aussergewöhnlicher Beanspruchungen festgestellt werden kann. Sie dient nicht zur Feststellung, ob ein Stoff unter beliebigen Bedingungen explosionsfähig ist.

Die Methode eignet sich zur Feststellung, ob ein Stoff unter den besonderen, in der Richtlinie festgelegten Bedingungen eine Explosionsgefahr darstellt (thermische und mechanische Empfindlichkeit). Sie beruht auf der Verwendung mehrerer Arten von Apparaturen, die international weit verbreitet sind (1) und die im allgemeinen aussagekräftige Ergebnisse ergeben. Dabei wird eingeräumt, daß die Methode keine endgültige Lösung darstellt. Es können andere als die genannten

Apparaturen verwendet werden, wenn diese international anerkannt sind und die Ergebnisse in angemessener Form mit denen aus den genannten Apparaturen korreliert werden können.

Die Prüfungen brauchen nicht vorgenommen zu werden, wenn verfügbare thermodynamische Daten (z.B. Bildungs-, Zersetzungsenthalpie) und/oder das Fehlen bestimmter reaktiver Gruppen (2) in der Strukturformel zweifelsfrei erkennen lassen, daß sich der Stoff nicht unter Bildung von Gasen oder Freisetzung von Wärme schnell zersetzen kann (d.h. die Substanz keine Explosionsgefahr darstellt). Eine Prüfung der mechanischen Empfindlichkeit bei Reibbeanspruchung ist für Flüssigkeiten nicht erforderlich.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Explosionsgefährlich:

Stoffe, die durch Flammenzuendung zur Explosion gebracht werden können oder die gegen Schlag oder Reibung in den genannten Apparaturen empfindlich sind (oder die in alternativen Apparaturen eine höhere mechanische Empfindlichkeit zeigen als 1,3-Dinitrobenzol).

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

1,3-Dinitrobenzol, kristallin, gesiebt auf Korngrösse 0,5 mm, technisches Produkt für die Prüfung der Schlag- und Reibempfindlichkeit.

Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX, Hexogen, Cyclonit - CAS 121-82-4), umkristallisiert aus wäßrigem Cyclohexanon, naßgesiebt durch ein Sieb 250 m und als Rückstand auf einem Sieb 150 m gewonnen, anschließend bei 103 2 C (über 4 Stunden) getrocknet für die zweite Reihe der Prüfung auf Schlag- und Reibempfindlichkeit.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Um sichere Bedingungen für die Ausführung der drei Empfindlichkeitsprüfungen zu finden, ist die Durchführung von Vorversuchen erforderlich.

1.4.1. Prüfung auf die Sicherheit des Umgangs mit der Substanz (3)

Aus sicherheitstechnischen Gründen werden vor Durchführung der Hauptprüfungen sehr kleine Proben (etwa 10 mg) der Prüfsubstanz ohne Einschluß mit einer Gasbrennerflamme erhitzt, in einem geeigneten Gerät einem Schlag ausgesetzt und unter Verwendung eines Reibstiftes und eines Widerlagers oder in einer beliebigen Reibmaschine gerieben. Das Ziel dieser Vorversuche ist festzustellen, ob der Stoff so empfindlich und so explosiv ist, daß zur Vermeidung von Verletzungen des Prüfenden bei der Durchführung der vorgeschriebenen Empfindlichkeitsprüfungen, insbesondere der Prüfung der thermischen Empfindlichkeit, besondere Schutzmaßnahmen vorzusehen sind.

1.4.2. Thermische Empfindlichkeit

Für die Prüfung wird die Prüfsubstanz in einer Stahlhülse erhitzt, die durch Düsenplatten mit Öffnungen verschiedenen Durchmessers verschlossen ist. Auf diese Weise wird bestimmt, ob der Stoff unter intensiver thermischer Beanspruchung bei definiertem Einschluß explodieren kann.

1.4.3. Mechanische Empfindlichkeit (Schlag)

Die Prüfung besteht darin, die Prüfsubstanz dem Schlag eines festgelegten Fallgewichtes aus einer festgelegten Höhe auszusetzen.

1.4.4. Mechanische Empfindlichkeit (Reibung)

Bei dieser Prüfung werden feste oder pastenförmige Substanzen der Reibung zwischen standardisierten Oberflächen unter festgelegten Bedingungen der Belastung und der relativen Bewegung ausgesetzt.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Nicht festgelegt.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Thermische Empfindlichkeit (Flammenzuendung)

1.6.1.1. Apparatur

Die Apparatur besteht aus einer nicht wiederverwendbaren Stahlhülse mit deren wiederverwendbarer Verschraubung (Abbildung 1), die in eine Heiz- und Schutzvorrichtung eingesetzt wird. Jede Hülse wird aus Blech im Tiefziehverfahren hergestellt (siehe Anlage) und hat einen inneren Durchmesser von 24 mm, eine Länge von 75 mm und eine Wanddicke von 0,5 mm. Am offenen Ende sind die Hülsen mit einem Bund versehen, an dem sie mit der Düsenplatte verschlossen werden können. Der Verschluß besteht aus einer druckfesten Düsenplatte mit einer zentrischen Bohrung, die mit der aus Gewindering und Mutter bestehenden Verschraubung fest mit einer Hülse verbunden wird. Gewindering und Mutter bestehen aus Chrom-Mangan-Stahl (siehe Anlage), der bis 800 C zunderfest ist. Die Düsenplatten sind 6 mm dick, bestehen aus warmfestem Stahl (siehe Anlage) und stehen mit verschiedenen Öffnungsdurchmessern zur Verfügung.

1.6.1.2. Versuchsbedingungen

Normalerweise wird die Substanz im Auslieferungszustand geprüft, obwohl in einigen Fällen, z.B. bei gepressten, gegossenen oder anderweitig verdichteten Stoffen, vor der Prüfung ein Zerkleinern erforderlich werden kann.

Bei Feststoffen wird die Menge des pro Prüfung zu verwendenden Materials durch ein zweistufiges Probeverfahren für die Befuellung bestimmt. Dabei wird eine gewogene Hülse mit 9 cm3 Prüfsubstanz gefuellt und die Prüfsubstanz unter Anwendung einer Kraft von 80 N, bezogen auf den Gesamtquerschnitt der Hülse, angedrückt. Aus sicherheitstechnischen Gründen oder in solchen Fällen, wo der Aggregatzustand der Probe durch Druck verändert werden kann, können andere Füllverfahren angewendet werden; wenn z.B. die Substanz sehr reibempfindlich ist, empfiehlt sich das Andrücken nicht. Wenn der Stoff sich als kompressibel erweist, wird weitere Substanz hinzugefügt und angedrückt, bis die Hülse bis zu einer Höhe von 55 mm vom Rand gefuellt ist. Danach wird die Gesamtmenge bestimmt, die für die Füllung bis zum Niveau von 55 mm unter dem Rand benötigt wurde, und es werden zwei weitere gleichgrosse Portionen zugegeben, wobei auch diese unter Anwendung einer Kraft von je 80 N angedrückt werden. Schließlich wird Substanz entweder zugefügt (unter Andrücken) oder ggf. entnommen, bis die Hülse bis zu einer Höhe von 15 mm unter dem Rand gefuellt ist. Dann wird eine zweite Probebefuellung durchgeführt, die mit einer angedrückten Menge von einem Drittel der Gesamtmenge der ersten Probebefuellung beginnt. Danach werden zwei weitere solche Portionen unter Anwendung von 80 N hinzugefügt und die Höhe der Substanz in der Hülse durch Hinzufügen oder Entnehmen bis auf 15 mm under dem Rand gebracht. Die bei der zweiten Probebefuellung ermittelte Feststoffmenge wird für jeden der eigentlichen Versuche verwendet, wobei das Füllen mit drei gleichgrossen Mengen vorgenommen wird, deren jede durch Anwendung der erforderlichen Kraft auf 9 cm3 komprimiert wird. (Dies kann durch Verwendung von Abstandsringen erleichtert werden.)

Flüssigkeiten und gelatinöse Substanzen werden in die Hülse bis zu einer Höhe von 60 mm eingefuellt, wobei im letzteren Fall besondere Sorge dafür zu tragen ist, daß keine Lunker gebildet werden. Der Gewindering wird von unten auf die Hülse aufgeschoben, die geeignete Düsenplatte eingesetzt und die Mutter nach Aufbringen eines Schmiermittels auf Molybdändisulfid-Basis angezogen. Es muß darauf geachtet werden, daß keine Substanz zwischen dem Bund und der Platte oder im Gewinde eingeschlossen ist.

Zum Aufheizen wird Propangas verwendet, das aus einer handelsüblichen Stahlflasche mit Druckminderer (60 bis 70 mbar) entnommen und über einen Durchflußmesser und einen Verteiler gleichmässig vier Brennern zugeführt wird (was durch Beobachtung der Flammen der einzelnen Brenner festgestellt werden kann). Die Brenner sind entsprechend Abbildung 1 an dem Schutzkasten angeordnet. Die vier Brenner haben zusammen einen Verbrauch von etwa 3,2 l Propan pro Minute. Die Verwendung alternativer Heizgase und Brenner ist möglich, doch muß die Heizgeschwindigkeit der in Abbildung 3 genannten entsprechen. Für alle Apparaturen ist die Heizgeschwindigkeit regelmässig unter Verwendung von Hülsen mit Dibutylphthalatfuellung zu kontrollieren (vgl. Abbildung 3).

1.6.1.3. Versuchsausführung

Jeder Versuch wird fortgeführt, bis die Stahlhülse entweder zerlegt oder fünf Minuten erhitzt worden ist. Ein Versuch, der zu einer Zerlegung der Hülse in drei oder mehr Teile führt (diese können in einigen Fällen noch durch schmale Metallstreifen miteinander verbunden sein - vgl. Abbildung 2), wird als Explosion eingestuft. Ein Versuch mit weniger Teilen oder überhaupt keiner Zerlegung wird nicht als Explosion eingestuft.

Zunächst wird eine erste Reihe mit drei Versuchen unter Verwendung einer Düsenplatte mit einem Öffnungsdurchmesser von 6,0 mm durchgeführt; wenn es hier zu keiner Explosion kommt, folgt eine zweite Reihe, ebenfalls mit drei Versuchen, mit einer Düsenplatte von 2,0 mm Öffnungsdurchmesser. Tritt während einer dieser Versuchsreihen eine Explosion ein, kann auf die Durchführung weiterer Versuche verzichtet werden.

1.6.1.4. Auswertung

Das Versuchsergebnis wird als positiv eingestuft, wenn es in einer der genannten Versuchsreihen zu einer Explosion kommt.

1.6.2. Mechanische Empfindlichkeit (Schlag)

1.6.2.1. Apparatur (Abbildung 4)

Die wesentlichen Teile eines typischen Fallhammers sind der Block aus Gußstahl mit Fuß, der Amboß, die Säule, die Führungsschienen, die Fallgewichte, die Auslösevorrichtung und ein Probenhalter. Der Stahlamboß (100 mm (Durchmesser) 70 mm (Höhe)) ist oben auf einen Stahlblock (230 mm (Länge) 250 mm (Breite) 200 mm (Höhe)) mit Fuß (450 mm (Länge) 450 mm (Breite) 60 mm (Höhe)) aufgeschraubt. Eine Säule aus nahtlos gezogenem Stahlrohr ist in einer Halterung befestigt, die auf der Rückseite des Stahlblocks angeschraubt ist. Der Fallhammer ist mit vier Steinschrauben auf einem massiven Betonsockel (60 cm 60 cm 60 cm) so verankert, daß die Führungsschienen absolut senkrecht stehen und das Fallgewicht leicht geführt wird. Fallgewichte zu 5 kg und 10 kg aus massivem Stahl stehen zur Verfügung. Der Schlageinsatz jedes Gewichts besteht aus gehärtetem Stahl, HRC 60 bis 63, und hat einen Mindestdurchmesser von 25 mm.

Die zu untersuchende Probe ist in eine Stempelvorrichtung einzuschließen, die aus zwei koaxial übereinanderstehenden Stahlstempeln und einem Hohlzylinder aus Stahl als Führungsring besteht. Die Stahlstempel, Abmessung 10 ( 0,003, 0,005) mm Durchmesser und 10 mm Höhe, müssen polierte Flächen, abgerundete Kanten (Krümmungsradius 0,5 mm) und eine Härte HRC 58 bis 65 haben. Der Hohlzylinder muß einen äusseren Durchmesser von 16 mm, eine geschliffene Bohrung von 10 (+0,005, +0,010) mm und eine Höhe von 13 mm haben. Die Stempelvorrichtung ist auf einen Zwischenamboß (26 mm Durchmesser, 26 mm Höhe) aus Stahl zu stellen und durch einen Zentrierring mit einem Lochkranz zum Abströmen der Explosionsschwaden zu zentrieren.

1.6.2.2. Versuchsbedingungen

Die Probe muß ein Volumen von 40 mm3 oder ein der verwendeten Alternativapparatur angepasstes Volumen haben. Feststoffe sind im trockenen Zustand zu prüfen und wie folgt vorzubereiten:

a) Pulverförmige Substanzen sind zu sieben (Maschenweite 0,5 mm); der gesamte Siebdurchgang ist zur Prüfung zu verwenden;

b) Gepresste, gegossene oder anderweitig verdichtete Substanzen sind zu zerkleinern und zu sieben; zur Prüfung ist die Siebfraktion 0,5 bis 1 mm Durchmesser zu verwenden; sie muß für die Originalsubstanz repräsentativ sein.

Substanzen, die in der Regel pastenförmig geliefert werden, sollten, wenn möglich, im trockenen Zustand geprüft werden, auf jeden Fall aber nach Entfernen der grösstmöglichen Menge an Verdünnungsmittel. Bei der Prüfung fluessiger Substanzen ist zwischen dem oberen und dem unteren Stahlstempel ein Abstand von 1 mm zu halten.

1.6.2.3. Versuchsausführung

Es werden sechs Einzelversuche unter Verwendung des Fallgewichts von 10 kg und Anwendung einer Fallhöhe von 0,40 m (40 J) ausgeführt. Wenn es während der sechs Versuche bei 40 J zu einer Explosion kommt, sind weitere sechs Einzelversuche mit einem Fallgewicht von 5 kg und einer Fallhöhe von 0,15 m (7,5 J) auszuführen. Bei Verwendung einer anderen Apparatur wird die Probe mit der gewählten Referenzsubstanz unter Benutzung einer anerkannten Auswertungsmethode (z.B. up-and-down technique usw.) verglichen.

1.6.2.4. Auswertung

Das Prüfergebnis wird als positiv eingestuft, wenn es mit der beschriebenen Apparatur zumindest in einem der genannten Versuche zu einer Explosion (eine Entflammung und/oder ein Knall steht einer Explosion gleich) kommt oder wenn bei Verwendung einer alternativen Apparatur die Probe empfindlicher ist als 1,3-Dinitrobenzol oder Hexogen (RDX).

1.6.3. Mechanische Empfindlichkeit (Reibung)

1.6.3.1. Apparatur (Abbildung 5)

Der Reibapparat besteht aus einer Grundplatte (Gußstahl), auf der die Reibvorrichtung, bestehend aus einem feststehenden Porzellanstift und einem beweglichen Porzellanplättchen, montiert ist. Das Porzellanplättchen ist in einem Schlitten befestigt, der in zwei Gleitschienen geführt wird. Der Schlitten wird mit einem Elektromotor über eine Schubstange, eine Exzenterscheibe und ein geeignetes Getriebe so angetrieben, daß das Porzellanplättchen unter dem Porzellanstift eine einmalige Hin- und Rückbewegung von 10 mm Länge ausführt. Der Porzellanstift kann z.B. mit 120 oder 360 N belastet werden.

Die flachen Porzellanplättchen sind aus rein weissem technischem Porzellan gefertigt (Rauhtiefe 9 m bis 32 m) und haben die Abmessungen 25 mm (Länge) 25 mm (Breite) 5 mm (Höhe). Der zylindrische Porzellanstift ist ebenfalls aus rein weissem technischem Porzellan gefertigt. Er ist 15 mm lang, hat einen Durchmesser von 10 mm und eine rauhe sphärische Endfläche mit einem Krümmungsradius von 10 mm.

1.6.3.2. Versuchsbedingungen

Die Probe muß ein Volumen von 10 mm3 oder ein der verwendeten Alternativapparatur angepasstes Volumen haben.

Feststoffe sind im trockenen Zustand zu prüfen und wie folgt vorzubereiten:

a) Pulverförmige Substanzen sind zu sieben (Maschenweite 0,5 mm); der gesamte Siebdurchgang ist zur Prüfung zu verwenden;

b) Gepresste, gegossene oder anderweitig verdichtete Substanzen sind zu zerkleinern und zu sieben; zur Prüfung ist die Siebfraktion ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Apparatur für die Prüfung auf thermische Empfindlichkeit

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Abbildung 2

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Prüfung auf thermische Empfindlichkeit

Beispiele für Splitterbilder

Abbildung 3

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Kalibrierung der Heizgeschwindigkeit für die Prüfung auf thermische Empfindlichkeit

Temperatur-/Zeitkurve bei Erwärmung von Dibutylphthalat (27 cm3) in einer (mit einer Düsenplatte mit Öffnungsdurchmesser 1,5 mm) verschlossenen Hülse bei einem Propanverbrauch von 3,2 l/min. Die Temperatur wird mit einem Chromel-/Alumel-Thermölement (Durchmesser: 1 mm) in einer Hülse aus rostfreiem Stahl gemessen, das zentral 43 mm unter dem Hülsenrand angebracht ist. Die Heizgeschwindigkeit muß im Bereich von 135 C bis 285 C zwischen 185 K/min und 215 K/min liegen.

Abbildung 4

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Apparatur zur Prüfung auf Schlagempfindlichkeit(alle Abmessungen in mm)

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Abbildung 4

Fortsetzung

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Abb. 4c Stempelvorrichtung für pulver-

Abb. 4d Stempelvorrichtung für Flüssigkeiten oder pastenförmige Substanzen

(1) Stahlstempel

(2) Führungsring für Stahlstempel

(3) Zentrierring mit Öffnungen

(a) Aufriß

(b) Grundriß

(4) Gummiring

(5) Flüssigkeit (40 mm3)

(6) fluessigkeitsfreier Raum

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Abb. 4e Hammer (Fallgewicht 5 kg)

(1) Zapfen

(2) Höhenmarkierung

(3) Führungsnut

(4) zylindrischer Schlageinsatz

(5) Rückprallsperre

Abbildung 5

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Apparatur zur Prüfung auf Reibempfindlichkeit

Abb. 5a Reibapparat;

Abb. 5b Ausgangsstellung des Stiftes Aufriß und Grundriß auf der Probe

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

A.15 ZUENDTEMPERATUR (FLÜSSIGKEITEN UND GASE)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Diese Prüfmethode gilt nicht für explosive Stoffe und solche, die sich bei Raumtemperatur spontan entzuenden. Das Prüfverfahren ist auf Gase, Flüssigkeiten und Dämpfe anwendbar, die sich in Gegenwart von Luft an einer heissen Oberfläche entzuenden können.

Die Zuendtemperatur kann durch katalytisch wirkende Verunreinigungen, durch das Oberflächenmaterial oder durch ein grösseres Volumen des Prüfgefässes erheblich herabgesetzt werden.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Die Zuendtemperatur stellt ein Maß für die Selbstentzuendlichkeit dar. Die Zuendtemperatur ist die niedrigste Temperatur, bei der sich die Prüfsubstanz im Gemisch mit Luft unter den im Prüfverfahren definierten Bedingungen entzuendet.

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Referenzsubstanzen sind in den Normen angegeben (siehe 1.6.3.). Sie sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Die Methode dient der Bestimmung der Mindesttemperatur von Behälterinnenflächen, durch die in diesem Behältnis befindliche Gase, Dämpfe oder Flüssigkeiten entzuendet werden können.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Die Wiederholbarkeit hängt ab vom Zuendtemperaturbereich und der angewandten Prüfmethode.

Die Empfindlichkeit und Spezifität hängen von der angewandten Prüfmethode ab.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Geräte

Die Prüfgeräte sind in den unter 1.6.3. genannten Methoden beschrieben.

1.6.2. Versuchsbedingungen

Die zu prüfende Substanz wird entsprechend den unter 1.6.3. genannten Methoden geprüft.

1.6.3. Versuchsausführung

Siehe IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF F 20-037.

2. DATEN

Registrieren von Versuchstemperatur, Luftdruck, Menge der eingesetzten Probe und Zuendverzögerungszeit.

3. BERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen);

- die Probenmenge, den Luftdruck;

- die verwendete Apparatur;

- die Messergebnisse (Prüftemperaturen, Ergebnisse hinsichtlich Zuendung, entsprechender Zeitverzug);

- alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der Ergebnisse wichtig sind.

4. LITERATUR

Keine.

A.16 RELATIVE SELBSTENTZUENDUNGSTEMPERATUR FÜR FESTSTOFFE

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Diese Prüfmethode gilt nicht für explosive Stoffe und solche, die sich bei Raumtemperatur an der Luft selbstentzuenden.

Zweck dieser Prüfung ist der Erhalt von vorläufigen Informationen über die Selbstentzuendlichkeit von festen Stoffen bei erhöhter Temperatur.

Wird die bei der Reaktion des Stoffes mit Sauerstoff oder bei der exothermen Zersetzung des Stoffes entstehende Wärme nicht schnell genug an die Umgebung abgegeben, so kommt es zur Selbsterhitzung mit nachfolgender Selbstentzuendung. Selbstentzuendung tritt somit ein, wenn die Wärmeentwicklung grösser ist als die Wärmeableitung.

Die Prüfmethode wird als Vorversuch für feste Substanzen angewendet. Wegen der komplexen Natur der Entzuendung und Verbrennung von festen Stoffen ist die mit dieser Methode bestimmte Selbstentzuendungstemperatur nur für Vergleichszwecke zu benutzen.

1.2. DEFINITION UND EINHEITEN

Die mit dieser Methode bestimmte Selbstentzuendungstemperatur ist die minimale Umgebungstemperatur in C, bei der sich unter definierten Bedingungen eine bestimmte Menge einer Substanz entzuendet.

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Eine bestimmte Menge der Prüfsubstanz wird bei Raumtemperatur in einen Ofen eingebracht. Während die Temperatur des Ofens mit einer Rate von 0,5 K/min auf 400 C oder bis zum Schmelzpunkt (wenn dieser niedriger liegt) erhöht wird, wird die Temperatur im Inneren der Probe gemessen und als Temperatur/Zeit-Kurve registriert. Bei diesem Verfahren wird diejenige Ofentemperatur, bei der die Probentemperatur durch Selbsterhitzung 400 C erreicht, als Selbstentzuendungstemperatur bezeichnet.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Gerät

1.6.1.1. Ofen

Ein Laboratoriumsofen (Volumen etwa 2 l) mit Temperaturprogrammierung, natürlicher Luftzirkulation und Explosionsdruckentlastung. Um Explosionsgefahr zu vermeiden, dürfen Schwelgase auf keinen Fall mit den elektrischen Heizdrähten in Berührung kommen.

1.6.1.2. Drahtnetz-Kubus

Ein Stück Drahtnetz aus rostfreiem Stahl mit einer Maschenweite von 0,045 mm wird entsprechend der Darstellung in Abbildung 1 zugeschnitten. Dieses Drahtnetz wird zu einem oben offenen Kubus gefaltet; die Kanten des Kubus werden fest mit Draht verbunden.

1.6.1.3. Thermölemente

Geeignete Thermölemente.

1.6.1.4. Registriergerät

Jedes Registriergerät mit zwei Meßkanälen, das für Temperaturen von 0 bis 600 C oder den entsprechenden Thermospannungs-Bereich kalibriert ist.

1.6.2. Versuchsbedingungen

Die Stoffe werden in ihrem Anlieferungszustand geprüft.

1.6.3. Versuchsausführung

Der Kubus wird mit der Prüfsubstanz gefuellt und der Inhalt durch leichtes Aufstossen verdichtet; es wird weitere Prüfsubstanz dazugegeben, bis der Kubus vollständig gefuellt ist. Der Kubus wird dann bei Raumtemperatur in die Mitte des Ofens eingesetzt. Ein Thermölement wird in die Mitte des Kubus und das andere zur Registrierung der Ofentemperatur zwischen dem Kubus und der Ofenwand angebracht.

Während die Temperatur des Ofens mit einer Rate von 0,5 K/min auf 400 C oder bis zum Schmelzpunkt (wenn dieser niedriger liegt) gesteigert wird, wird die Temperatur des Ofens und der Probe kontinuierlich aufgezeichnet.

Wenn sich die Prüfsubstanz entzuendet, zeigt das Thermölement der Probe einen starken Temperaturanstieg über die Ofentemperatur hinaus.

2. DATEN

Diejenige Temperatur des Ofens, bei der die Probentemperatur durch Selbsterhitzung 400 C erreicht, ist für die Beurteilung maßgebend (siehe Abbildung 2).

3. BERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- eine Beschreibung der Prüfsubstanz;

- die Messergebnisse einschließlich der Temperatur/Zeit-Kurve;

- alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der Ergebnisse wichtig sind.

4. LITERATUR

(1) NF T 20-036 (SEPT. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

Abbildung 1

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Muster des Testkubus (Kantenlänge 20 mm)

Abbildung 2

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Typische Temperatur/Zeit-Kurve

A.17. BRANDFÖRDERNDE EIGENSCHAFTEN (FESTSTOFFE)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Es ist zweckdienlich, vor Ausführung dieses Versuchs Informationen über mögliche explosive Eigenschaften der Substanz zu haben.

Dieses Verfahren kann nicht auf Flüssigkeiten, Gase, explosive oder leichtentzuendliche Substanzen oder organische Peroxide angewendet werden.

Die Prüfung braucht nicht ausgeführt zu werden, wenn die Prüfung der Strukturformel zweifelsfrei ergibt, daß die Substanz mit brennbarem Material nicht exotherm reagieren kann.

Zur Ermittlung der Sicherheitsvorkehrungen für die Versuchsausführung ist es notwendig, einen Vorversuch durchzuführen.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Abbrandzeit: Diejenige Zeit in Sekunden, in der sich die Reaktionszone über die Schüttung ausbreitet, gemäß dem unter 1.6. beschriebenen Verfahren.

Abbrandgeschwindigkeit: anzugeben in mm/s.

Hoechste Abbrandgeschwindigkeit: Die höchsten Werte der Abbrandgeschwindigkeiten von Gemischen mit Massenanteilen an Oxidationsmitteln von 10 bis 90 %.

1.3. REFERENZSUBSTANZ

Als Referenzsubstanz für die Prüfung und den Vorversuch wird Bariumnitrat (analysenrein) verwendet.

Referenzgemisch ist dasjenige Gemisch aus Bariumnitrat und Cellulosepulver, das gemäß 1.6. hergestellt wurde und die höchste Abbrandgeschwindigkeit hat (üblicherweise ein Gemisch mit einem Massenanteil an Bariumnitrat von 60 %).

1.4. PRINZIP DER METHODE

Der Vorversuch wird aus Gründen der Sicherheit ausgeführt. Wenn der Vorversuch eindeutig ergibt, daß die Substanz brandfördernde Eigenschaften hat, sind keine weiteren Prüfungen erforderlich. Liegt ein solches eindeutiges Ergebnis nicht vor, so ist mit der Substanz der Hauptversuch auszuführen.

Für den Hauptversuch werden die Prüfsubstanz und eine definierte brennbare Substanz in verschiedenen Gewichtsverhältnissen gemischt. Jedes Gemisch wird dann zu Schüttungen geformt und diese Schüttungen werden an einem Ende gezuendet. Die höchste ermittelte Abbrandgeschwindigkeit wird mit der höchsten Abbrandgeschwindigkeit des Referenzgemisches verglichen.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Es ist jede Methode der Zerkleinerung und Mischung geeignet, die dazu führt, daß bei den sechs getrennten Versuchen die maximale Abbrandgeschwindigkeit vom arithmetischen Mittelwert um nicht mehr als 10 % abweicht.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

1.6.1.1. Prüfsubstanz

Die Prüfsubstanz wird nach dem folgenden Verfahren auf eine Korngrösse von ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Form und Zubehör zur Herstellung der Schüttung(alle Massangaben in mm)

TEIL B: METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER TOXIZITÄT ALLGEMEINE EINLEITUNG: TEIL B

A. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung.

B. DEFINITIONEN

(i) Akute Toxizität umfasst die schädigenden Auswirkungen, die innerhalb eines bestimmten Zeitraumes (meistens 14 Tage) nach Verabreichung einer Einzeldosis einer Substanz auftreten.

(ii) LD50 (mittlere letale Dosis) ist die statistisch errechnete Einzeldosis einer Substanz, die voraussichtlich bei 50 % der exponierten Tiere tödlich wirkt. Der LD50-Wert wird angegeben als Gewicht der Testsubstanz pro Gewichtseinheit des Versuchstieres (mg/kg Körpergewicht).

(iii) LC50 (mittlere letale Konzentration) ist die statistisch errechnete Konzentration einer Substanz, die voraussichtlich bei 50 % der exponierten Tiere während einer definierten Expositionszeit oder innerhalb einer bestimmten Zeit danach zum Tode führt. Der LC50-Wert wird als Menge der Testsubstanz pro Standardluftvolumen (mg/l) angegeben.

(iv) NEL-Wert (N adverse effect level) ist die höchste Dosis oder maximale Expositionskonzentration, die noch keine feststellbaren Anzeichen einer toxischen Wirkung verursacht.

(v) Subakute/subchronische Toxizität umfasst die schädigenden Auswirkungen, die bei Versuchstieren als Ergebnis wiederholter täglicher Verabreichung oder Exposition gegenüber chemischen Substanzen auftreten. Die Behandlungsdauer erstreckt sich über eine kurze Zeit im Verhältnis zur tierartspezifischen Lebenszeit.

(vi) Maximal verträgliche Dosis (Maximum tolerated dose - MTD) ist die höchste Dosis, die bei Tieren Anzeichen einer Toxizität verursacht, ohne jedoch wesentliche Auswirkungen auf die Überlebenszeit der Tiere während der jeweiligen Testdauer zu zeigen.

(vii) Unter Hautreizung versteht man das Auslösen von reversiblen Entzuendungserscheinungen an der Haut nach Verabreichung einer Prüfsubstanz.

(viii) Unter Augenreizung versteht man das Auslösen von reversiblen Änderungen am Auge nach Verabreichung einer Prüfsubstanz auf die Oberfläche des Auges.

(ix) Hautsensibilisierung (allergische Kontaktdermatitis) ist eine immunologisch vermittelte Hautreaktion, die durch eine Prüfsubstanz bedingt wurde.

Spezielle Definitionen für die Inhalationstoxizität

- ein Aerosol wird definiert als homogen in der Luft verteilte (feste und/oder fluessige) Partikel.

- der ärodynamische Durchmesser ist der Durchmesser einer Kugel mit einer Dichte von 1 (1 g/cm 3), die die gleiche Endsinkgeschwindigkeit hat wie das betreffende Partikel.

- der mittlere ärodynamische Massendurchmesser (Maß Median Ärodynamic Diameter - MMAD) ist der berechnete ärodynamische Durchmesser, der die Grössenverteilung des Aerosols bei Messung nach der Masse halbiert.

- die geometrische Standardabweichung (Geometric Standard Deviation - GSD) ist das Verhältnis zwischen dem geschätzten 84-Perzentil und dem 50-Perzentil. Sie gibt die Steigung der kumulativen Partikelgrössenverteilungskurve an, wobei davon ausgegangen wird, daß es sich um eine logarithmisch normale Grössenverteilung handelt.

Definitionen zur Fest-Dosis Methode bei der Bestimmung der akuten oralen Toxizität

- offensichtliche Toxizität bezieht sich auf die Vergiftungserscheinungen, die im Anschluß an die Verabreichung einer Prüfsubstanz auftreten und die so schwerwiegend sind, daß die Verabreichung der nächsthöheren Dosis zum Tode führen könnte.

- Hoechste nicht letale Dosis ("discriminating dose") ist die höchste von vier festgesetzten Dosierungen, die verabreicht werden kann, ohne daß die substanzbedingte Mortalität eintritt (einschließlich vorzeitiger Tötungen aus Tierschutzgründen).

C. MUTAGENITÄT (einschließlich Karzinogenitäts-Vorversuch)

Für eine vorläufige Abschätzung des mutagenen Potentials einer Substanz benötigt man Informationen über zwei Arten von Endpunkten, nämlich Genmutationen und Chromosomenaberrationen.

Diese beiden Endpunkte werden durch folgende Prüfungen bewertet:

(i) Prüfungen über die Auslösung von Gen(Punkt)-Mutationen in prokaryotischen Zellen wie Salmonella typhimurium; akzeptabel ist auch der Einsatz von Escherichia coli. Die Art der Prüfchemikalie ist ggf. für die Wahl eines der beiden Testorganismen entscheidend.

(ii) Untersuchungen zur Auslösung von Chromosomenaberrationen an in vitro kultivierten Säugerzellen; ein in vivo-Verfahren (Mikronukleus-Test oder die Metaphasenanalyse von Knochenmarkzellen) ist ebenfalls brauchbar. Jedoch sollten, wenn nicht besondere Gründe vorliegen, die in vitro-Methoden bevorzugt Anwendung finden.

D. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Es gibt Grenzen bei der direkten Übertragbarkeit der Ergebnisse der Tier- und in vitro-Versuche auf den Menschen, was bei der Bewertung und Interpretation von Prüfungen zu berücksichtigen ist.

Wenn Hinweise auf schädigende Auswirkungen auf den Menschen vorhanden sind, so sollten diese bei der Bestimmung der potentiellen Wirkungen chemischer Substanzen auf den Menschen berücksichtigt werden.

E. LITERATURHINWEISE

Die Toxikologie ist eine ständig fortschreitende experimentelle Wissenschaft; zu allen Themenkreisen ist umfangreiche Literatur vorhanden. Entsprechende Angaben sind in den Prüfrichtlinien der ÖCD enthalten.

Ergänzende Bemerkungen

Tierpflege

Wesentlich für toxikologische Untersuchungen sind strenge Kontrollen der Umweltbedingungen sowie gute, den jeweiligen Tierarten angemessene Tierpflege.

(i) Haltungsbedingungen

Die Umweltbedingungen in den Versuchstierräumen sind den jeweiligen Tierarten anzupassen. Für Ratten, Mäuse und Meerschweinchen ist eine Raumtemperatur von 22 3 C bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 30-70 % angezeigt; für Kaninchen sollte die Temperatur 20 3 C bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 30-70 % betragen.

Einige Untersuchungsmethoden sind besonders temperaturempfindlich. Für diese Fälle sind Einzelheiten über entsprechende Voraussetzungen in der Beschreibung des Prüfverfahrens enthalten. Bei allen Untersuchungen auf toxische Wirkungen sind Temperatur und Luftfeuchtigkeit zu überwachen, aufzuzeichnen und in den Endbericht der Untersuchung aufzunehmen.

Bei künstlicher Beleuchtung sollen die Licht- und Dunkelfolgen jeweils zwölf Stunden betragen. Einzelheiten des Beleuchtungsmusters sind aufzuzeichnen und in den Untersuchungsbericht aufzunehmen.

Wesentlich für Berichte über Tierversuche ist ausserdem der Hinweis auf die Art der Käfighaltung sowie die Anzahl der in einem Käfig untergebrachten Tiere sowohl während der Exposition durch die Prüfsubstanz als auch während der darauf folgenden Beobachtungszeit.

(ii) Fütterungsbedingungen

Das Futter muß allen ernährungswissenschaftlichen Anforderungen für die jeweils eingesetzte Tierart entsprechen. Werden den Tieren Prüfsubstanzen im Futter verabreicht, so kann sich der Nährwert durch Wechselwirkung zwischen der jeweiligen Substanz und einem Nahrungsmittelbestandteil verringern.

Die Möglichkeit einer solchen Reaktion muß bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden.

Verunreinigungen in der Nahrung, die sich nachweislich auf die Toxizität auswirken, dürfen nicht in beeinträchtigenden Konzentrationen vorhanden sein.

Schutz der Tiere

Bei der Erarbeitung der Prüfverfahren wurde der Schutz der Tiere in angemessener Weise berücksichtigt. Im folgenden werden kurz einige Beispiele angegeben, doch ist die Liste nicht vollständig. Der exakte Wortlaut und/oder die exakten Bedingungen sind dem Wortlaut der Prüfverfahren zu entnehmen:

- Zur Bestimmung der akuten oralen Toxizität wird ein alternatives Verfahren, die sogenannte "Fest-Dosis-Methode"eingeführt. Im Gegensatz zu anderen Methoden wird bei diesem Verfahren nicht der Tod als der spezifische Endpunkt des Versuchs angesehen. Es werden weniger Tiere benötigt, die weniger Schmerzen und Qualen zu ertragen haben, als dies bei der klassischen Bestimmung der akuten oralen Toxizität der Fall ist.

- Die Anzahl der im Versuch verwendeten Tiere ist auf das wissenschaftlich annehmbare Minimum reduziert: für die Verfahren B.1 und B.3 werden lediglich fünf Tiere des gleichen Geschlechts pro Dosierung geprüft; für die Bestimmung der Sensibilisierung der Haut beim Meerschweinchen-Maximierungstest (Verfahren B.6) werden lediglich 10 Tiere, und für die negative Kontrollgruppe nur 5 Tiere benötigt; die Anzahl der Tiere, die für die positive Kontrollgruppe bei der Prüfung der Mutagenität in vivo eingesetzt werden, wird ebenfalls gesenkt (Verfahren B.11 und B.12).

- Die Tiere haben während des Versuchs weniger Schmerzen und Qual zu erleiden: Tiere mit schweren und anhaltenden Zeichen von Schmerz können vorzeitig getötet werden unter Verwendung einer tierschutzgerechten Methode; es brauchen keine Versuche mit Substanzdosen durchgeführt werden, die aufgrund ihrer ätzenden oder reizenden Wirkungen deutlich Schmerzen und Qualen verursachen (Verfahren B.1, B.2 und B.3).

- Die Prüfung von für diese Versuche nicht relevanten hohen Dosierungen wird durch die Durchführung von Limit-Tests vermieden; dies gilt nicht nur für die Prüfung der akuten Toxizität (Verfahren B.1, B.2 und B.3) sondern auch für die in vivo-Mutagenitätstests (Verfahren B.11 und B.12).

- Sofern ausreichende wissenschaftliche Nachweise dafür vorgelegt werden können, kann die Prüfung der Reizung gegebenfalls wegfallen beziehungsweise auf einen Versuch mit einem einzigen Tier begrenzt werden.

Diese wissenschaftlichen Erkentnisse können sich auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz, auf die Ergebnisse anderer Prüfungen oder die Ergebnisse gut validierter in vitro-Prüfungen gründen. Wenn z.B. eine Prüfung der akuten Toxizität (dermal) mit der Limit-Testdosis der Substanz (Verfahren B.3) durchgeführt und dabei keine Hautreizung beobachtet wurde, kann sich ein weiteres Prüfen auf Hautreizungen (Verfahren B.4) als unnötig erweisen; Substanzen, die eindeutig ätzende Wirkungen oder schwere Hautreizungen bereits in einer Prüfung auf Hautreizungen (Verfahren B.4) verursacht haben, sollten nicht weiter auf eine Augenreizwirkung geprüft werden (Verfahren B.5).

B.1. AKUTE TOXIZITÄT (ORAL)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITIONEN

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt B).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Die Prüfsubstanz wird in abgestuften Dosierungen mehreren Versuchstiergruppen oral mit der Schlundsonde verabreicht, und zwar eine Dosierung je Gruppe. Die Wahl der Dosierungen kann auf der Basis eines Dosis-Findungs-Tests beruhen. Anschließend werden die beobachteten Vergiftungserscheinungen und Todesfälle registriert. Tiere, die während des Versuchs sterben, sowie die bei Versuchsende überlebenden Tiere werden seziert. Diese Methode wird in erster Linie bei Untersuchungen mit Nagetieren angewandt.

Tiere mit schweren und anhaltenden Anzeichen von Leiden und Schmerzen können unter Verwendung einer tierschutzgerechten Methode getötet werden. Substanzen, von denen bekannt ist, daß sie auf diesem Wege aufgrund ihrer ätzenden oder reizenden Wirkungen ausgeprägte Schmerzen und Leiden verursachen, brauchen nicht geprüft zu werden.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

Vor der Untersuchung werden die Tiere für einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen unter experimentellen Haltungs- und Fütterungsbedingungen eingewöhnt. Vor Versuchsbeginn werden gesunde junge erwachsene Tiere randomisiert und den einzelnen Behandlungsgruppen zugeordnet. Falls erforderlich, wird die Prüfsubstanz suspendiert bzw. in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst. Es wird empfohlen, möglichst zuerst eine wäßrige Lösung zu wählen, gefolgt von einer Lösung in Pflanzenöl oder anderer geeigneter Lösungsvermittler oder einer Suspension. Bei nicht wäßrigen Formulierungshilfsmitteln müssen deren relevante toxikologische Eigenschaften bekannt sein, anderenfalls sind sie vor oder während des Versuchs zu bestimmen. Bei Nagetieren sollte das Volumen normalerweise 10 ml/kg Körpergewicht nicht überschreiten; ausgenommen sind wäßrige Lösungen, von denen bis zu 20 ml/kg Körpergewicht verabreicht werden können. Unterschiedliche Volumina sollten durch Anpassung der Konzentration so gering wie möglich gehalten werden, um ein konstantes Volumen in allen Dosierungen zu gewährleisten.

1.6.2. Prüfbedingungen

1.6.2.1. Versuchstiere

Sofern nicht besondere Gründe vorliegen, ist die Ratte zu bevorzugen.

Es sind bekannte Versuchstierstämme zu verwenden. Für jedes Geschlecht sollte die Schwankung des Körpergewichts der Tiere des jeweiligen Versuchs bei Versuchsbeginn nicht mehr als 20 % vom entsprechenden Mittelwert betragen.

1.6.2.2. Anzahl und Geschlecht

Mindestens 5 Nagetiere sind für jede Dosierung zu verwenden. Sie sollten alle vom gleichen Geschlecht sein. Wenn weibliche Tiere verwendet werden, dürfen sie weder geworfen haben noch trächtig sein. Wenn es Hinweise darauf gibt, daß ein Geschlecht deutlich empfindlicher reagiert, sollten Tiere dieses Geschlechts verwendet werden.

Anmerkung: Bei Prüfungen der akuten Toxizität an Tieren, die einer höheren Ordnung angehören als Nagetiere, sollte die Verwendung einer geringeren Anzahl von Tieren in Betracht gezogen werden.

Die Dosierungen sollten sorgfältig ausgewählt und grosser Wert darauf gelegt werden, mässig toxische Dosierungen nicht zu überschreiten. Bei solchen Versuchen sollte die Verabreichung der Prüfsubstanz in letalen Dosen vermieden werden.

1.6.2.3. Dosierungen

Die Dosisgruppen (mindestens 3) müssen ausreichen, um nach entsprechenden Abstufungen Versuchsgruppen mit toxischen Wirkungen und Mortalitätsraten zu erhalten. Die erhaltenen Daten sollen eine Dosis-Wirkungs-Beziehung aufzeigen und - soweit möglich - eine Bestimmung der LD50 erlauben.

1.6.2.4. Limit-Test

Wenn Nagetiere verwendet werden, kann ein Limit-Test mit einer einzigen Dosierung von mindestens 2 000 mg/kg Körpergewicht an einer Gruppe von 5 männlichen und 5 weiblichen Tieren unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Wenn substanzbedingte Todesfälle festgestellt werden, kann ein vollständiger Test notwendig werden.

1.6.2.5. Beobachtungszeitraum

Der Beobachtungszeitraum sollte mindestens 14 Tage betragen. Die Dauer der Beobachtung soll jedoch nicht starr festgelegt werden. Sie soll von der Art des Vergiftungsbildes, dem zeitlichen Auftreten der Symptome und der Dauer der Erholungsphase abhängig gemacht werden. Die Beobachtungszeit ist zu verlängern, falls es sich als notwendig erweist. Der Zeitpunkt, zu dem Vergiftungserscheinungen auftreten und wieder abklingen, sowie der Zeitpunkt des Todes sind von Bedeutung, vor allem dann, wenn Anzeichen für eine verzögerte Mortalität erkennbar sind.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Vor Verabreichung der Prüfsubstanz sollen die Tiere kein Futter erhalten. Bei Ratten sollte eine Nacht lang kein Futter verabreicht werden. Bei Tieren mit einer höheren Stoffwechselrate reicht eine kürzere Nahrungskarenz aus; Trinkwasser kann unbegrenzt verabreicht werden. Am folgenden Tag werden die Tiere gewogen, und die Prüfsubstanz wird in einer einmaligen Dosis mit der Schlundsonde verabreicht. Ist eine einmalige Dosierung nicht möglich, kann die zu applizierende Dosis in Teilmengen über einen Zeitraum von höchstens 24 Stunden verabreicht werden. Nach Verabreichung der Prüfsubstanz soll der Futterentzug für weitere 3-4 Stunden beibehalten werden. Wird die Prüfsubstanz in Teilmengen während eines grösseren Zeitraums verabreicht, kann es erforderlich sein, den Tieren je nach Länge der Exposition Futter und Wasser zu geben.

Nach der Verabreichung werden die Beobachtungen für jedes Tier individuell aufgezeichnet und festgehalten. Die Beobachtungen sind während des ersten Tages häufig durchzuführen.

Mindestens einmal jeden Werktag sollte eine sorgfältige klinische Untersuchung erfolgen. Andere tägliche Beobachtungen und entsprechende Vorkehrungen sollen dem Ziel dienen, den Verlust an Tieren für die Studie weitestgehend einzuschränken, z. B. durch Autopsie oder Kühlung tot aufgefundener Tiere und durch Isolierung oder Tötung schwacher oder sterbender Tiere. Die Beobachtungen sind auszurichten auf Veränderungen von Haut, Fell, Augen, Schleimhäuten, Atmung und Kreislauf, autonomem und zentralem Nervensystem sowie an der Somatomotorik und am Verhaltensmuster. Besonderes Augenmerk ist auf Tremor, Konvulsionen, Salivation, Diarrhoee, Lethargie, Schlaf und Koma zu richten. Der Zeitpunkt des Todes ist so genau wie möglich festzuhalten.

Die während des Versuchs gestorbenen und die bis zum Abschluß des Versuchs überlebenden Tiere werden seziert. Alle pathologischen Veränderungen sind zu protokollieren. Falls erforderlich, sollten Gewebe für eine histopathologische Untersuchung entnommen werden.

Bewertung der Toxizität beim jeweils anderen Geschlecht

Nach Beendigung des Versuchs mit Tieren eines bestimmten Geschlechts wird die Prüfsubstanz mindestens einer Gruppe von 5 Tieren des anderen Geschlechts verabreicht, um festzustellen, ob Tiere dieses Geschlechts nicht deutlich empfindlicher auf die Substanz reagieren. Unter bestimmten Bedingungen kann die Verwendung einer geringeren Anzahl von Tieren gerechtfertigt sein. Wenn ausreichend Hinweise dafür vorliegen, daß die Tiere des geprüften Geschlechts deutlich empfindlicher reagieren, kann auf eine Prüfung der Tiere des jeweils anderen Geschlechts verzichtet werden.

2. DATEN

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus müssen für jede Versuchsgruppe die Zahl der Tiere zu Beginn des Versuchs, der Zeitpunkt des Todes der einzelnen Tiere, die Zahl der Tiere mit weiteren Anzeichen der Giftwirkung, die Beschreibung der toxischen Auswirkungen und die Sektionsbefunde hervorgehen. Die Bestimmung des Gewichts der einzelnen Tiere erfolgt unmittelbar vor Verabreichung der Prüfsubstanz, danach in wöchentlichen Abständen und zum Zeitpunkt des Todes. Gewichtsveränderungen sind zu bestimmen und aufzuzeichnen, sofern die Tiere länger als einen Tag überleben. Tiere, die aufgrund substanzbedingter Leiden und Schmerzen vorzeitig getötet werden, werden als substanzbedingte Todesfälle registriert. Die LD50 ist mit einer anerkannten Methode zu berechnen. Die Auswertung sollte auch - soweit möglich - die Beziehung zwischen Verabreichungsdosis sowie Auftreten und Grad aller Abnormitäten einschließlich Verhaltensänderungen, klinischer Symptome, schwerer Schädigungen, Körpergewichtsveränderungen, Mortalität und sonstiger toxikologischer Auswirkungen umfassen.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. Prüfbericht

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Tierart, Stamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter, usw.;

- Versuchsbedingungen;

- Dosierungsgruppen (ggf. Lösungsvermittler und Konzentrationen);

- Geschlecht der behandelten Tiere;

- Auflistung der Daten nach Geschlecht und Dosierung (Zahl der während des Versuchs gestorbenen oder getöteten Tiere, Zahl der Tiere mit Vergiftungserscheinungen, Zahl der exponierten Tiere);

- Zeitpunkt des Todes nach Verabreichung der Prüfsubstanz, Gründe und Kriterien für das vorzeitige Töten der Tiere;

- sämtliche Beobachtungen;

- LD50-Wert für das Geschlecht, das einem vollständigen Versuch unterzogen wurde, nach einem Beobachtungszeitraum von 14 Tagen (unter Angabe der Berechnungsmethode);

- 95 %-Vertrauensbereich für die LD50 (soweit möglich);

- Dosis/Mortalitätskurve und Slope-Faktor (falls durch die Bestimmungsmethode möglich);

- Sektionsbefunde;

- ggf. histopathologische Befunde;

- ggf. Ergebnisse aus Versuchen mit Tieren des jeweils anderen Geschlechts;

- Diskussion der Ergebnisse (besondere Beachtung sollte der Wirkung geschenkt werden, die das vorzeitige Töten von Tieren während des Versuchs auf den berechneten LD50-Wert haben kann);

- Interpretation der Ergebnisse.

3.2. Bewertung und Interpretation

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

B.1 bis. AKUTE TOXIZITÄT (ORAL) - FEST-DOSIS-METHODE

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITIONEN

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt B).

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Die akute orale Toxizitätsprüfung liefert Informationen über die nachteiligen Auswirkungen, die die Verabreichung einer einzelnen Dosis der Prüfsubstanz innerhalb eines kurzen Zeitraumes zur Folge hat.

Die Fest-Dosis Methode wird in zwei Stufen ausgeführt.

In einem ersten Dosisfindungstest werden die Auswirkungen von verschiedenen, mit der Schlundsonde verabreichten Dosierungen, an einzelnen Tieren eines einzigen Geschlechts, sequentiell untersucht. Mit dem Dosisfindungstest werden Angaben über die Dosis-Toxizität-Beziehung, einschließlich der Schätzung der minimalen letalen Dosis ermittelt. Im Normalfall werden in dieser ersten Stufe nicht mehr als 5 Tiere untersucht.

Im Haupttest wird die Prüfsubstanz oral mit der Schlundsonde an Gruppen von 5 männlichen und 5 weiblichen Versuchstieren in einer der zuvor festgesetzten Dosierungen (5, 50, 500 oder 2 000 mg/kg) verabreicht. Die gebrauchte Dosierung wird vom Dosisfindungstest ermittelt und entspricht der Dosierung, die voraussichtlich eine offensichtliche Toxizität (siehe 1.2 Definitionen), aber keinen Todesfall erbringt.

Nach der Verabreichung werden die Tiere beobachtet.Wenn die zuerst gewählte Dosierung eine offensichtliche toxische Wirkung zeigt, jedoch keine substanzbedingte Mortalität bewirkt, ist eine weitere Prüfung nicht erforderlich.

Ruft die gewählte Dosierung keine offensichtliche toxische Wirkung hervor, sollte die Prüfsubstanz in der nächsthöheren Dosierung erneut geprüft werden. Sterben die Tiere oder erfordern die Anzeichen von starken toxischen Wirkungen ein vorzeitiges Töten der Tiere, sollte die Prüfsubstanz in der nächstniedrigeren Dosierung erneut geprüft werden.

Dieses Verfahren gestattet die Ermittlung der höchsten nichtletalen Dosis ("discriminating dose", siehe 1.2 Definitionen), d. h. dies ist die höchste der zuvor festgesetzten Dosierungen, die ohne Todesfolge verabreicht werden kann (einschließlich vorzeitiger Tötungen).

Tiere, die starke und anhaltende Zeichen von Qual und Schmerz zeigen, können ggf. vorzeitig getötet werden. Substanzen in Prüfdosen, von denen bekannt ist, daß sie auf diesem Wege aufgrund ihrer ätzenden oder reizenden Eigenschaften ausgeprägte Leiden und Schmerzen verursachen, brauchen nicht geprüft zu werden.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

1.6.1.1. Versuchstiere

Soweit keine besonderen Gründe vorliegen, ist die Ratte zu bevorzugen.

Es sind bekannte Versuchstierstämme zu verwenden. Für jedes Geschlecht sollte die Schwankung des Körpergewichts der Tiere des jeweiligen Versuchs nicht mehr als 20 % vom entsprechenden Mittelwert betragen.

Vor der Untersuchung werden die Tiere für einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen unter experimentellen Haltungs- und Fütterungsbedingungen eingewöhnt. Vor Versuchsbeginn werden gesunde junge erwachsene Tiere randomisiert und den Dosisfindungstest- und Haupttestbehandlungsgruppen zugeordnet. In der Praxis, kann möglicherweise im Haupttest nur eine Gruppe jedes Geschlechts benötigt werden.

1.6.1.2. Dosisbereitung und -verabreichung

Falls erforderlich, wird die Prüfsubstanz gelöst oder in einem geeigneten Lösungsvermittler suspendiert. Es wird empfohlen, nach Möglichkeit an erster Stelle eine wäßrige Lösung zu wählen, gefolgt von einer Lösung in Pflanzenöl oder anderen geeigneten Lösungsmitteln bzw. einer Suspension. Bei nichtwäßrigen Formulierungshilfen müssen deren relevante toxikologische Eigenschaften bekannt sein. Andernfalls sind sie vor oder während des Versuchs zu bestimmen. Bei Nagetieren sollte das Volumen normalerweise 10 ml/kg Körpergewicht nicht überschreiten; ausgenommen sind wäßrige Lösungen, von denen bis zu 20 ml/kg verabreicht werden können. Unterschiedliche Volumina sollten durch Anpassung der Konzentration so gering wie möglich gehalten werden, um ein konstantes Volumen in allen Dosierungen zu gewährleisten.

Vor Verabreichung der Prüfsubstanz sollen die Tiere kein Futter erhalten. Bei Ratten sollte eine Nacht lang kein Futter verabreicht werden; Trinkwasser kann unbegrenzt verabreicht werden. Am folgenden Tag werden die Tiere gewogen, und die Prüfsubstanz wird in einer einmaligen Dosis oral mit der Schlundsonde verabreicht. Ist eine einmalige Dosierung nicht möglich, kann die zu applizierende Dosis in Teilmengen über einen Zeitraum von höchstens 24 Stunden gegeben werden. Nach Verabreichung der Prüfsubstanz soll der Futterentzug für weitere drei bis vier Stunden beibehalten werden. Wird eine Prüfsubstanz in Teilmengen während eines grösseren Zeitraums verabreicht, kann es erforderlich sein, den Tieren je nach Länge der Exposition Futter und Wasser zu geben.

1.6.2. Versuchsdurchführung

1.6.2.1. Dosisfindungstest

Die Auswirkungen verschiedener Dosierungen werden bei einzelnen Tieren untersucht. In der Regel, und wenn keine Angaben auf eine grössere Sensibilität des männlichen Geschlechts hinweisen, werden weibliche Versuchstiere verwendet. Die Dosierung erfolgt sequentiell, d.h. mit einem Zeitraum von mindestens 24 Stunden, bevor die Dosierung dem nächsten Tier verabreicht wird. Alle Tiere werden sorgfältig auf Vergiftungsanzeichen während mindestens 7 Tagen beobachtet; wenn mässige Vergiftungsanzeichen über 7 Tage andauern, wird die Beobachtungszeit um 7 weitere Tage für jenes Tier verlängert. Es sollte eine der folgenden Anfangsdosierungen ausgewählt werden: 5, 50, 500 oder 2 000 mg/kg. Ruft die ausgewählte Anfangsdosierung keine schwere Toxizität hervor, und wird Mortalität von der nächsthöheren Dosierung ausgelöst, ist es erforderlich, eine oder mehrere zwischenstufige Dosierungen zu untersuchen. So wird es möglich sein, sowohl über Vergiftungsanzeichen hervorbringende Dosierung(en), als auch über die niedrigste, die Mortalität verursachende Dosierung Angaben zu sammeln.

Es soll danach gestrebt werden, die Anfangsdosierung aus Angaben über ähnliche Stoffe abzuleiten. Fehlen solche Angaben, wird angeraten, die 500 mg/kg Dosierung als erste zu verwenden. Treten nach Verabreichung der Anfangsdosierung keine Vergiftungserscheinungen auf, so wird die nächsthöhere Dosierung untersucht. Bewirkt eine Dosierung von 2 000 mg/kg keine Mortalität, wird der Dosisfindungstest als abgeschlossen angesehen. Der Haupttest sollte danach mit dieser Dosierung ausgeführt werden. Machen schwere Auswirkungen als Folge einer Anfangsdosierung (z.B. 500 mg/kg) eine vorzeitige Tötung erforderlich, wird die nächstniedrigere Dosierung (z.B. 50 mg/kg) einem anderen Tier verabreicht. Überlebt das Tier den Versuch, können weiteren Tieren angepasste, zwischen den festgesetzten Dosierungen gelegene Dosen verabreicht werden. Es sollten voraussichtlich nicht mehr als 5 Tiere mit diesem Verfahren untersucht werden.

1.6.2.2. Haupttest

Mindestens 10 Tiere (5 weibliche und 5 männliche) sind für jede ermittelte Dosierung zu verwenden. Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein.

Ein Grundsatz der Fest-Dosis-Methode ist es, daß nur mässig toxische Dosen in der Hauptstudie benutzt werden. Die Verabreichung letaler Dosen der Prüfsubstanz sollte vermieden werden.

Die im Versuch zu verwendende Prüfsubstanz sollte aus einer der vier festgelegten Dosierungen, das sind 5, 50, 500 oder 2 000 mg/kg Körpergewicht, ausgewählt werden. Die Anfangsdosierung ist so zu wählen, daß sie offensichtliche toxische Wirkungen hervorruft, jedoch keine substanzbedingte Mortalität eintritt (einschließlich vorzeitiger Tötungen; zufällige Todesfälle werden nicht einbezogen, sollten jedoch aufgezeichnet werden). Ein weiterer Versuch ist nicht erforderlich, wenn diese Dosierung offensichtliche Vergiftungserscheinungen hervorruft, jedoch keine substanzbedingte Mortalität bewirkt.

Hat die Verabreichung der gewählten Dosierung keine offensichtlichen toxischen Wirkungen zur Folge, sollte der Versuch mit der nächsthöheren Dosierung wiederholt werden. Die Tiere sollten jedoch weiterhin bis zum Abschluß des Beobachtungszeitraums beobachtet werden. Machen offensichtliche Vergiftungserscheinungen eine vorzeitige Tötung der Tiere erforderlich oder kommt es zu substanzbedingter Mortalität, sollte der Versuch mit der nächstniedrigeren Dosierung wiederholt werden. Tiere, die nicht vorzeitig getötet werden müssen, sollten auch hier während des gesamten Beobachtungszeitraums unter Beobachtung bleiben.

Nach der Verabreichung werden die Beobachtungen systematisch festgehalten. Für jedes Versuchstier werden die Beobachtungen gesondert registriert.

Der Beobachtungszeitraum sollte mindestens 14 Tage betragen. Die Dauer der Beobachtung soll jedoch nicht starr festgelegt, sondern von der Art des Vergiftungsbildes, dem zeitlichen Auftreten der Symptome und der Dauer der Erholungsphase abhängig gemacht werden. Die Beobachtungszeit ist zu verlängern, falls es sich als notwendig erweist. Der Zeitpunkt, zu dem Vergiftungserscheinungen auftreten und wieder abklingen sowie der Zeitpunkt des Todes sind von Bedeutung, vor allem dann, wenn Anzeichen für ein verzögertes Auftreten von Vergiftungserscheinungen erkennbar sind.

Am Tag der Verabreichung sollte mindestens zweimal und an jedem der darauffolgenden Tage mindestens einmal eine sorgfältige klinische Untersuchung erfolgen. Tiere, die offensichtlich unter Schmerzen leiden oder starke Anzeichen von Qual zeigen, sollten vorzeitig getötet werden. Weisen die Tiere weiterhin Vergiftungserscheinungen auf, sollten zusätzliche Beobachtungen während der ersten Tage nach der Verabreichung durchgeführt werden. Der Versuch kann beendet werden, wenn die zuerst gewählte Dosierung sich offensichtlich als zu hoch erwiesen hat.

Beobachtungen sind auszurichten auf Veränderungen von Haut, Fell, Augen, Schleimhäuten, Atmung und Kreislauf, autonomem und zentralem Nervensystem sowie Somatomotorik und Verhaltensmuster. Besonderes Augenmerk sind auf Tremor, Konvulsionen, Salivation, Diarrhoe, Lethargie, Schlaf und Koma zu richten.

Die Bestimmung des Gewichts der einzelnen Tiere erfolgt unmittelbar vor Verabreichung der Prüfsubstanz, anschließend einmal täglich während der folgenden drei Tage und danach in wöchentlichen Abständen. Die während des Versuchs gestorbenen und die bis zum Abschluß des Versuchs überlebenden Tiere werden gewogen und seziert. Alle pathologischen Veränderungen sind zu protokollieren. Falls erforderlich, sollten Gewebe für eine histopathologische Untersuchung entnommen werden.

Die Prüfung einer zweiten oder, in Ausnahmefällen, einer dritten Dosierung kann je nach den Ergebnissen mit der vorangegangenen Dosierung erforderlich sein.

Führt eine Prüfsubstanz bei 5 mg/kg Körpergewicht zum Tod (bzw. wenn der Dosisfindungstest dies schließen lässt), sollte die akute Toxizität der Prüfsubstanz ggf. weiter untersucht werden.

2. DATEN

Die Daten aus dem Dosisfindungstest und dem Haupttest sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus müssen für jede geprüfte Dosierung die Anzahl der Tiere zu Beginn des Versuchs, die Anzahl der Tiere mit Vergiftungsanzeichen, die Anzahl der Tiere, die während des Versuchs tot aufgefunden bzw. vorzeitig getötet wurden, eine Beschreibung der toxischen Auswirkungen und, für den Haupttest, der ggf. substanzbedingten nachweisbaren Vergiftungserscheinungen, der zeitliche Verlauf von Vergiftungserscheinungen sowie die Sektionsbefunde hervorgehen. Gewichtsveränderungen sind zu bestimmen und aufzuzeichnen, sofern die Tiere länger als einen Tag überleben.

Tiere, die aufgrund substanzbedingter Leiden und Schmerzen vorzeitig getötet wurden, werden als substanzbedingte Todesfälle registriert.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben, sowohl für den Dosisfindungstest als auch für den Haupttest:

- Tierarten, Stamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;

- Versuchsbedingungen;

- Dosierungsgruppen (ggf. Lösungsvermittler und Konzentrationen);

- vollständige Ergebnisse aller geprüften Dosierungen;

- Auflistung der Daten nach Geschlecht und Dosierung (Zahl der verwendeten Tiere, Veränderungen des Körpergewichts, ggf. Anzahl der Tiere, die während des Versuchs starben oder getötet wurden, Anzahl der Tiere mit Vergiftungserscheinungen, Art, Schweregrad und Dauer der Wirkung);

- zeitlicher Verlauf ab Beginn der Vergiftungserscheinungen und Angaben darüber, ob diese reversibel waren oder nicht;

- bei gestorbenen bzw. getöteten Tieren Angaben über den Zeitpunkt des Todes nach der Verabreichung, Gründe und Kriterien für die vorzeitige Tötung der Tiere;

- Sektionsbefunde;

- ggf. histopathologische Befunde;

- Diskussion der Ergebnisse;

- Interpretation der Ergebnisse, einschließlich der Anzeichen von offensichtlichen toxischen Wirkungen und der im Versuch ermittelten höchsten nicht letalen Dosis ("discriminating dose").

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Siehe auch allgemeine Einleitung Teil B (D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (E).

B.2. AKUTE TOXIZITÄT (INHALATION)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Es ist vorteilhaft, vorläufige Angaben zur Partikelgrössenverteilung, zum Dampfdruck, Schmelzpunkt, Siedepunkt, Flammpunkt und zur Explosivität (falls zutreffend) der Substanz zu haben.

Siehe auch allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITIONEN

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt B).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Mehrere Versuchstiergruppen werden mit der Prüfsubstanz in abgestuften Konzentrationen für eine bestimmte Zeit exponiert, und zwar eine Konzentration je Gruppe. Anschließend werden die beobachteten Auswirkungen und Todesfälle registriert. Tiere, die während des Versuchs sterben, sowie die bei Versuchsende überlebenden Tiere werden seziert.

Tiere mit schweren und anhaltenden Anzeichen von Leiden und Schmerzen können vorzeitig getötet werden. Substanzen, von denen bekannt ist, daß sie auf diesem Wege aufgrund ihrer ätzenden oder stark reizenden Wirkungen ausgeprägte Schmerzen und Leiden verursachen, brauchen nicht geprüft zu werden.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

Die Tiere werden vor Versuchsbeginn für einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen unter experimentellen Haltungs- und Fütterungsbedingungen eingewöhnt. Vor dem Versuch werden gesunde junge erwachsene Tiere randomisiert und den einzelnen Behandlungsgruppen zugeordnet. Eine simulierte Exposition ist nur dann erforderlich, wenn es die verwendete apparative Expositionsbedingung notwendig macht.

Bei festen Prüfsubstanzen kann eine Mikronisierung erforderlich sein, um Partikel einer geeigneten Grösse zu erhalten.

Falls erforderlich, kann der Prüfsubstanz ein geeignetes Vehikel zugefügt werden, um die erforderliche Konzentration der Prüfsubstanz in der Atmosphäre herzustellen. In diesem Fall muß jedoch eine Kontrollgruppe, die nur das Vehikel enthält, eingesetzt werden. Wird der Dosierung zur Vereinfachung der Verabreichung ein Vehikel oder ein sonstiger Zusatz eingefügt, müssen deren relevante toxische Eigenschaften bekannt sein. Es können ggf. Daten aus früheren Versuchen herangezogen werden.

1.6.2. Prüfbedingungen

1.6.2.1. Versuchstiere

Sofern nicht besondere Gründe vorliegen, ist die Ratte zu bevorzugen. Es sind bekannte Versuchstierstämme zu verwenden. Für jedes Geschlecht sollte die Schwankung des Körpergewichts der Tiere des jeweiligen Versuchs bei Versuchsbeginn nicht mehr als 20 % vom entsprechenden Mittelwert betragen.

1.6.2.2. Anzahl und Geschlecht

Mindestens 10 Nagetiere (5 weibliche und 5 männliche) sind für jede Konzentration zu verwenden. Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein.

Anmerkung: Bei Prüfungen der akuten Toxizität an Tieren, die einer höheren Ordnung angehören als Nagetiere, sollte die Verwendung einer geringeren Anzahl an Tieren in Betracht gezogen werden. Die Dosierungen sollten sorgfältig ausgewählt und grosser Wert darauf gelegt werden, mässig toxische Dosierungen nicht zu überschreiten. Bei solchen Versuchen sollte die Verabreichung der Prüfsubstanz in letalen Dosen vermieden werden.

1.6.2.3. Expositionskonzentrationen

Die Dosisgruppen (mindestens 3) müssen ausreichen, um nach entsprechenden Abstufungen Versuchsgruppen mit toxischen Wirkungen und Mortalitätsraten zu erhalten. Die erhaltenen Daten sollen ausreichend sein, um eine Konzentration-Mortalitäts-Kurve aufzuzeigen und - soweit möglich - eine annehmbare Bestimmung der LC50 erlauben.

1.6.2.4. Limit-Test

Wenn nach einer 4-stuendigen Exposition an 5 männlichen und 5 weiblichen Tieren von 5 mg/l eines Gases oder eines Aerosols einer fluessigen oder festen Substanz (oder in den Fällen, wenn dies wegen der physikalischen oder chemischen, einschließlich der explosiven Eigenschaften der Prüfsubstanz, nicht möglich ist die maximal erreichbare Konzentration), innerhalb von 14 Tagen keine substanzbedingte Mortalität ermittelt wird, werden weitere Versuche nicht für notwendig erachtet.

1.6.2.5. Expositionszeit

Die Expositionszeit sollte vier Stunden betragen.

1.6.2.6. Ausrüstung

Für die Tierversuche soll eine Inhalationsanlage benutzt werden, die einen dynamischen Luftstrom mit einem Luftwechsel von mindestens 12 mal pro Stunde sowie einen adäquaten Sauerstoffgehalt und eine gleichmässig verteilte Expositionsatmosphäre gewährleistet. Wird eine Kammer verwendet, so ist sie so zu gestalten, daß die Versuchstiere möglichst wenig zusammengedrängt werden und die Exposition durch Inhalation der Prüfsubstanz maximiert wird. Um die Stabilität der Atmosphäre in der Inhalationskammer sicherzustellen, sollte grundsätzlich das "Gesamtvolumen" der Versuchstiere 5 % des Kammervolumens nicht überschreiten. Für Expositionen des Mund-Nasen-Bereichs, des Kopfes oder des Ganzkörpers sind spezielle Inhalationskammern zu verwenden. Die beiden ersten Expositionsarten sollen dazu beitragen, die Aufnahme der Prüfsubstanz auf anderen Wegen soweit wie möglich einzuschränken.

1.6.2.7. Beobachtungszeitraum

Der Beobachtungszeitraum sollte mindestens 14 Tage betragen. Die Dauer der Beobachtung soll jedoch nicht starr festgelegt werden. Sie soll von der Art des Vergiftungsbildes, dem zeitlichen Auftreten der Symptome und der Dauer der Erholungsphase abhängig gemacht werden. Die Beobachtungszeit ist zu verlängern, falls es sich als notwendig erweist. Der Zeitpunkt, bei dem Vergiftungserscheinungen auftreten und wieder abklingen, sowie der Zeitpunkt des Todes sind von Bedeutung, vor allem dann, wenn Anzeichen für eine verzögerte Mortalität erkennbar sind.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Die Tiere werden unmittelbar vor der Exposition gewogen und nach Einstellung des Gleichgewichts der Kammerkonzentration der Prüfsubstanz in der dazu bestimmten Apparatur über einen Zeitraum von vier Stunden ausgesetzt. Die Einstellung des Gleichgewichts sollte nur wenig Zeit in Anspruch nehmen. Die Temperatur soll während des Versuchs 22 3 C betragen. Die relative Luftfeuchtigkeit soll zwischen 30 und 70 % gehalten werden, ausgenommen in den Fällen, wo dies nicht durchführbar ist (z. B. Versuche mit einigen Aerosolen). Das Aufrechterhalten eines leichten Unterdrucks in der Kammer (5 mm Wasser) verhindert das Entweichen der Prüfsubstanz in die Umgebung. Während der Exposition werden weder Futter noch Wasser verabreicht. Es soll ein geeignetes System zur Erzeugung und Überwachung der Prüfatmosphäre benutzt werden. Das System soll gewährleisten, daß konstante Expositionsbedingungen so schnell wie möglich erreicht werden. Die Kammer sollte so angelegt sein und bedient werden, daß eine homogene Verteilung der Prüfatmosphäre in der Kammer aufrechterhalten wird.

Die folgenden Messungen oder Überwachungen sollten durchgeführt werden:

(a) Messungen der Luftdurchflußrate (kontinuierlich)

(b) Die tatsächliche Konzentration der Prüfsubstanz wird während der Exposition im Atembereich mindestens dreimal gemessen (in einigen Atmosphärenarten, z. B. Aerosolen in hohen Konzentrationen, kann eine häufigere Überwachung notwendig sein). Während der Expositionsdauer sollte die Konzentration um nicht mehr als 15 % vom Mittelwert abweichen. Bei einigen Aerosolen ist dieses Prüfniveau möglicherweise nicht erreichbar. In diesem Fall wird ein grösserer Streubereich akzeptiert. Für Aerosole ist eine Analyse der Partikelgrösse so oft wie möglich durchzuführen (mindestens einmal pro Versuchsgruppe).

(c) Temperatur und Luftfeuchtigkeit (möglichst ständig).

Während und nach der Exposition werden die Tiere beobachtet und die Befunde für jedes Tier aufgezeichnet. Die Beobachtungen sind während des ersten Tages häufig durchzuführen. Mindestens einmal an jedem Werktag sollte eine sorgfältige klinische Untersuchung erfolgen. Andere tägliche Beobachtungen und entsprechende Vorkehrungen sollen dem Ziel dienen, den Verlust an Tieren für die Studie weitestgehend einzuschränken, z. B. durch Autopsie oder Kühlung tot aufgefundener Tiere bzw. durch Isolierung oder Tötung schwacher oder sterbender Tiere.

Diese Beobachtungen beinhalten Veränderungen von Haut, Fell, Augen, Schleimhäuten, Atmung und Kreislauf, autonomem und zentralem Nervensystem sowie an der Somatomotorik und am Verhaltensmuster. Besonderes Augenmerk ist auf Tremor, Atmung, Konvulsionen, Salivation, Diarrhoe, Lethargie, Schlaf und Koma zu richten. Der Zeitpunkt des Todes ist so genau wie möglich festzuhalten. Das Gewicht der Einzeltiere soll nach der Exposition wöchentlich und zum Zeitpunkt des Todes festgestellt werden.

Die während des Versuchs gestorbenen und die bis zum Abschluß des Versuchs überlebenden Tiere werden seziert unter besonderer Berücksichtigung aller Veränderungen im oberen und unteren Atmungstrakt. Alle pathologischen Veränderungen sind zu protokollieren. Falls erforderlich, sollten Gewebe für eine histopathologische Untersuchung entnommen werden.

2. DATEN

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus müssen für jede Versuchsgruppe die Zahl der Tiere zu Beginn des Versuchs, der Zeitpunkt des Todes der einzelnen Tiere, die Zahl der Tiere mit weiteren Anzeichen der Giftwirkung, die Beschreibung der toxischen Auswirkungen und die Sektionsbefunde hervorgehen. Gewichtsveränderungen sind zu bestimmen und aufzuzeichnen, sofern die Tiere länger als einen Tag überleben. Tiere, die aufgrund substanzbedingter Leiden und Schmerzen vorzeitig getötet werden, werden als substanzbedingte Todesfälle registriert. Die LC50 ist mit einer anerkannten Methode zu berechnen. Die Auswertung sollte auch - soweit möglich - die Beziehung zwischen Verabreichungsdosis sowie Auftreten und Grad aller Abnormitäten einschließlich Verhaltensänderungen, klinischer Symptome, schwerer Schädigungen, Körpergewichtsveränderungen, Mortalität und sonstiger toxikologischer Auswirkungen umfassen.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Tierart, Stamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;

- Versuchsbedingungen:

Beschreibung des Expositionsapparates einschließlich Gestaltung, Typ, Abmessungen, Luftquelle, System zur Aerosolerzeugung, Klimatisierungssystem und Art der Unterbringung der Tiere in der Versuchskammer (wenn verwendet). Die Geräte zur Messung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Aerosolkonzentration sowie Teilchengrössenverteilung sind zu beschreiben.

Expositionsdaten

Diese Daten sind in tabellarischer Form zusammenzustellen und unter Angabe von Mittelwerten und Berücksichtigung der Schwankungen (z. B. Standardabweichung) darzustellen. Sie müssen folgende Angaben enthalten:

(a) Luftdurchflußrate in der Inhalationsanlage;

(b) Temperatur und Luftfeuchtigkeit;

(c) nominale Konzentration (Gesamtmenge der Prüfsubstanz, die in die Inhalationsanlage eingegeben wurde, dividiert durch das Luftvolumen);

(d) ggf. Art des Vehikels;

(e) tatsächliche Konzentrationen im Atembereich;

(f) der mittlere ärodynamische Massendurchmesser (Maß Median Ärodynamic Diameter - MMAD) und die geometrische Standardabweichung (Geometric Standard Deviation - GSD);

(g) Zeit für die Gleichgewichtseinstellung;

(h) Expositionsdauer;

- Auflistung der Daten nach Geschlecht und Konzentration (Zahl der während des Versuchs gestorbenen oder getöteten Tiere; Zahl der Tiere mit Vergiftungserscheinungen; Zahl der exponierten Tiere);

- Zeitpunkt des Todes während oder nach Verabreichung der Prüfsubstanz, Gründe und Kriterien für das vorzeitige Töten der Tiere;

- sämtliche Beobachtungen;

- LC50-Wert für jedes Geschlecht, ermittelt am Ende der Beobachtungszeit (unter Angabe der Berechnungsmethode);

- 95 %-Vertrauensbereich für die LC50 (soweit möglich);

- Dosis/Mortalitätskurve und Slope-Faktor (falls durch die Bestimmungsmethode möglich);

- Sektionsbefunde;

- ggf. histopathologische Befunde;

- Diskussion der Ergebnisse (besondere Beachtung sollte dem Einfluß geschenkt werden, der das vorzeitige Töten von Tieren während des Versuchs auf den berechneten LC50-Wert haben kann);

- Interpretation der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

B.3. AKUTE TOXIZITÄT (DERMAL)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITIONEN

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt B).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Die Prüfsubstanz wird in abgestuften Dosierungen mehreren Versuchstiergruppen auf die Haut aufgetragen, und zwar eine Dosierung je Gruppe. Anschließend werden die beobachteten Vergiftungserscheinungen und Todesfälle registriert. Tiere, die während des Versuchs sterben, sowie die bei Versuchsende überlebenden Tiere werden seziert.

Tiere mit starken und anhaltenden Anzeichen von Leiden und Schmerzen können vorzeitig getötet werden; Substanzen, von denen bekannt ist, daß sie auf diesem Wege aufgrund ihrer ätzenden oder reizenden Wirkungen ausgeprägte Schmerzen und Leiden verursachen, brauchen nicht geprüft zu werden.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

Vor der Untersuchung werden die Tiere für einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen unter experimentellen Haltungs- und Fütterungsbedingungen in geeigneten Käfigen eingewöhnt. Vor Versuchsbeginn werden gesunde, junge erwachsene Tiere randomisiert und den einzelnen Behandlungsgruppen zugeordnet. Etwa 24 Stunden vor Versuchsbeginn wird das Fell der Versuchstiere auf dem Rücken durch Scheren oder Rasieren entfernt. Beim Scheren oder Abrasieren des Fells ist darauf zu achten, daß die Haut nicht verletzt wird, da dies zu einer Veränderung der Durchlässigkeit führen könnte. Mindestens 10 % der Körperoberfläche wird für die Applikation der Prüfsubstanz vorbereitet. Werden feste Stoffe verwendet, die gegebenenfalls pulverisiert werden können, sollte die Prüfsubstanz ausreichend mit Wasser oder ggf. einem geigneten Vehikel angefeuchtet werden, um einen guten Kontakt mit der Haut sicherzustellen. Bei der Verwendung eines Vehikels ist dessen Einfluß auf das Eindringen der Prüfsubstanz in die Haut zu berücksichtigen. Flüssige Prüfsubstanzen werden im allgemeinen unverdünnt angewendet.

1.6.2. Prüfbedingungen

1.6.2.1. Versuchstiere

Es können erwachsene Ratten oder Kaninchen verwendet werden. Auch andere Tierarten können verwendet werden, jedoch muß ihre Verwendung begründet werden. Es sollen bekannte Versuchstierstämme verwendet werden. Für jedes Geschlecht sollte die Schwankung des Körpergewichts der Tiere des jeweiligen Versuchs bei Versuchsbeginn nicht mehr als 20 % vom entsprechenden Mittelwert betragen.

1.6.2.2. Anzahl und Geschlecht

Mindestens 5 Tiere sind für jede Konzentration zu verwenden. Sie sollten alle vom gleichen Geschlecht sein. Wenn weibliche Tiere benutzt werden, dürfen diese weder geworfen haben noch trächtig sein. Wenn es Hinweise darauf gibt, daß ein Geschlecht deutlich empfindlicher reagiert, sollten Tiere dieses Geschlechts verwendet werden.

Anmerkung: Bei Prüfungen der akuten Toxizität an Tieren, die einer höheren Ordnung angehören als Nagetiere, sollte die Verwendung einer geringeren Anzahl an Tieren in Betracht gezogen werden. Die Dosierungen sollten sorgfältig ausgewählt und grosser Wert darauf gelegt werden, mässig toxische Dosierungen nicht zu überschreiten. Bei solchen Versuchen sollte die Verabreichung der Prüfsubstanz in letalen Dosen vermieden werden.

1.6.2.3. Dosierungen

Die Dosisgruppen (mindestens 3) sollten ausreichen, um nach entsprechenden Abstufungen Versuchsgruppen mit unterschiedlichen toxischen Wirkungen und Mortalitätsraten zu erhalten. Bei der Festlegung der Dosierungen sollte eine mögliche reizende oder ätzende Wirkung berücksichtigt werden. Die erhaltenen Daten sollten ausreichen, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve aufzuzeigen und - soweit möglich - eine annehmbare Bestimmung der LD50 erlauben.

1.6.2.4. Limit-Test

Es kann ein Limit-Test mit einer einzigen Dosierung von mindestens 2 000 mg/kg Körpergewicht an einer Gruppe von 5 männlichen und 5 weiblichen Tieren unter Verwendung der oben beschriebenen

Verfahren durchgeführt werden. Wenn substanzbedingte Todesfälle festgestellt werden, sollte ein vollständiger Test erwogen werden.

1.6.2.5. Beobachtungszeitraum

Der Beobachtungszeitraum sollte mindestens 14 Tage betragen. Die Dauer der Beobachtung soll jedoch nicht starr festgelegt werden. Sie soll von der Art des Vergiftungsbildes, dem zeitlichen Auftreten der Symptome und der Dauer der Erholungsphase abhängig gemacht werden. Die Beobachtungszeit ist zu verlängern, falls es sich als notwendig erweist. Der Zeitpunkt, zu dem Vergiftungserscheinungen auftreten und wieder abklingen, ihre Dauer sowie der Zeitpunkt des Todes sind von Bedeutung, vor allem dann, wenn Anzeichen für eine verzögerte Mortalität erkennbar sind.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Die Tiere sollen einzeln in Käfigen gehalten werden. Die Prüfsubstanz ist einheitlich auf einen Bereich aufzutragen, der etwa 10 % der Körperoberfläche entspricht. Bei hochtoxischen Substanzen kann die behandelte Oberfläche kleiner sein; es sollte jedoch ein möglichst grosser Bereich mit einer möglichst dünnen und einheitlichen Schicht behandelt werden.

Die Prüfsubstanz muß während einer Expositionszeit von 24 Stunden mittels eines porösen Mullverbandes und eines nicht reizenden Pflasters Kontakt mit der Haut haben. Die Versuchsfläche ist ausserdem auf geeignete Art abzudecken, um den Mullverband und die Prüfsubstanz zu fixieren und sicherzustellen, daß die Tiere die Prüfsubstanz nicht oral aufnehmen können. Es können auch Mittel zur Einschränkung der Bewegungsfreiheit angewendet werden, damit die Tiere die Prüfsubstanz nicht oral aufnehmen können; eine vollständige Immobilisierung ist jedoch nicht zu empfehlen.

Nach Ablauf der Expositionszeit werden die Reste der Prüfsubstanz entfernt, soweit möglich unter Verwendung von Wasser oder mit einem anderen geeigneten Hautreinigungsverfahren.

Die Beobachtungen sind systematisch aufzuzeichnen. Für jedes Tier sind individuelle Aufzeichnungen anzufertigen. Am ersten Tag sind die Tiere häufig zu beobachten. Mindestens einmal pro Werktag sollte eine sorgfältige klinische Untersuchung erfolgen. Andere tägliche Beobachtungen und entsprechende Vorkehrungen sollen dem Ziel dienen, den Verlust an Tieren für die Studie weitestgehend einzuschränken, z. B. durch Autopsie oder Kühlung tot aufgefundener Tiere und durch Isolierung oder Tötung schwacher oder sterbender Tiere.

Die Beobachtungen beinhalten Veränderungen von Fell, behandelter Haut, Augen, Schleimhäuten, Atmung und Kreislauf, autonomem und zentralem Nervensystem sowie an der Somatomotorik und am Verhaltensmuster. Besonderes Augenmerk ist auf Tremor, Konvulsionen, Salivation, Diarrhoe, Lethargie, Schlaf und Koma zu richten. Der Zeitpunkt des Todes ist so genau wie möglich festzuhalten. Die während des Versuchs gestorbenen und die bis zum Abschluß des Versuchs überlebenden Tiere werden seziert. Alle pathologischen Veränderungen sind zu protokollieren. Falls erforderlich, sollten Gewebe für eine histopathologische Untersuchung entnommen werden.

Bewertung der Toxizität beim jeweils anderen Geschlecht

Nach Beendigung des Versuchs mit Tieren eines bestimmten Geschlechts wird die Prüfsubstanz mindestens einer Gruppe von 5 Tieren des jeweils anderen Geschlechts verabreicht, um festzustellen, ob Tiere dieses Geschlechts nicht deutlich empfindlicher auf die Substanz reagieren. Unter bestimmten Bedingungen kann die Verwendung einer geringeren Anzahl von Tieren gerechtfertigt sein. Wenn ausreichend Hinweise dafür vorliegen, daß die Tiere des geprüften Geschlechts deutlich empfindlicher reagieren, kann auf eine Prüfung der Tiere des jeweils anderen Geschlechts verzichtet werden.

2. DATEN

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus müssen für jede Versuchsgruppe die Zahl der Tiere zu Beginn des Versuchs, der Zeitpunkt des Todes der einzelnen Tiere, die Zahl der Tiere mit weiteren Anzeichen der Giftwirkung, die Beschreibung der toxischen Wirkungen und die Sektionsbefunde hervorgehen. Die Bestimmung des Gewichts der einzelnen Tiere erfolgt unmittelbar vor Verabreichung der Prüfsubstanz, danach in wöchentlichen Abständen und zum Zeitpunkt des Todes. Gewichtsveränderungen sind zu bestimmen und aufzuzeichnen, sofern die Tiere länger als einen Tag überleben. Tiere, die aufgrund substanzbedingter Leiden und Schmerzen vorzeitig getötet werden, werden als substanzbedingte Todesfälle registriert. Die LD50 ist mit einer anerkannten Methode zu berechnen.

Die Auswertung sollte auch - soweit vorhanden - die Beziehung zwischen Verabreichungsdosis sowie Auftreten und Schweregrad aller Abnormitäten einschließlich Verhaltensänderungen, klinischer Symptome, schwerer Schäden, Körpergewichtsveränderungen, Mortalität und sonstiger toxikologischer Wirkungen umfassen.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Tierart, Stamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter, usw.;

- Versuchsbedingungen (einschließlich des Hautreinigungsverfahrens und der Art des Verbandes: okklusiv oder semi- okklusiv);

- Dosierungen (ggf. mit Vehikel, falls verwendet, und Konzentrationen);

- Geschlecht der behandelten Tiere;

- Auflistung der Daten nach Geschlecht und Dosierung (Zahl der während des Versuchs gestorbenen oder getöteten Tiere, Zahl der Tiere mit Vergiftungserscheinungen, Zahl der exponierten Tiere);

- Zeitpunkt des Todes nach Auftragen der Prüfsubstanz, Gründe und Kriterien für das vorzeitige Töten der Tiere;

- sämtliche Beobachtungen;

- LD50-Wert für das Geschlecht, das einem vollständigen Versuch unterzogen wurde, Bestimmung nach 14 Tagen (unter Angabe der Berechnungsmethode);

- 95 %-Vertrauensbereich für die LD50 (soweit möglich);

- Dosis/Mortalitätskurve und Slope-Faktor (falls durch die Bestimmungsmethode möglich);

- Sektionsbefunde;

- ggf. histopathologische Befunde;

- ggf. Ergebnisse aus Versuchen mit Tieren des jeweils anderen Geschlechts;

- Diskussion der Ergebnisse (besondere Beachtung sollte dem Einfluß geschenkt werden, der das vorzeitige Töten von Tieren während des Versuchs auf den errechneten LD50-Wert haben kann);

- Interpretation der Ergebnisse.

3.2. Bewertung und Interpretation

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

B.4. AKUTE TOXIZITÄT (HAUTREIZUNG)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITIONEN

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt B).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Vorbetrachtungen

Alle verfügbaren Informationen über eine Substanz sind sorgsam in Rechnung zu stellen, um das Prüfen von Substanzen unter Bedingungen, die voraussichtlich zu starken Reaktionen führen, auf ein Minimum zu beschränken. Folgende Informationen können bei der Beantwortung der Frage behilflich sein, ob ein vollständiger Test, eine Studie an nur einem Tier oder keine weiteren Versuche durchgeführt werden sollen.

(i) Physikalisch-chemische Eigenschaften und chemische Reaktivität: Stark saure oder alkalische Prüfsubstanzen (z. B. nachgewiesener pH-Wert von 2 oder darunter bzw. 11,5 oder darüber) brauchen nicht auf primäre Hautreizungen geprüft zu werden, wenn ätzende Wirkungen erwartet werden können. Eine alkalische oder saure Reserve ist ebenfalls zu berücksichtigen.

(ii) Wenn eindeutige Hinweise auf starke Wirkungen anhand gut validierter in-vitro-Tests vorliegen, kann die Durchführung einer vollständigen Prüfung nicht erforderlich sein.

(iii) Ergebnisse aus Prüfungen der akuten Toxizität. Wenn eine Prüfung der akuten Toxizität (dermal) mit der Limittestdosis der Substanz (2 000 mg/kg Körpergewicht) durchgeführt und keine Hautreizung beobachtet wurde, kann unter Umständen sich ein weiteres Prüfen auf Hautreizungen als unnötig erweisen; auch die Prüfung von Stoffen, die sich bei dermaler Verabreichung als sehr giftig herausgestellt haben, ist nicht erforderlich.

Die Prüfsubstanz wird in einer einmaligen Dosierung auf die Haut mehrerer Versuchstiere aufgetragen, wobei jedes Tier als seine eigene Kontrolle dient. Der Grad der Reizung wird nach einer festgesetzten Zeit bestimmt und bewertet und anschließend beschrieben, um eine umfassende Beurteilung der Wirkung vornehmen zu können. Die Beobachtungsdauer sollte ausreichend sein, um die Reversibilität der Wirkungen vollständig zu erfassen.

Tiere mit starken und anhaltenden Anzeichen von Leiden und Schmerzen können vorzeitig getötet werden.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

Etwa 24 Stunden vor dem Versuch wird das Fell auf dem Rücken der Versuchstiere geschoren oder rasiert.

Dabei ist darauf zu achten, daß die Haut nicht verletzt wird. Es sind nur Tiere mit einer gesunden, unverletzten Haut zu verwenden.

Einige Kaninchenrassen haben Stellen mit dichtem Fellbewuchs, die zu bestimmten Zeiten im Jahr deutlicher hervortreten. Die Prüfsubstanzen sind nicht auf diese Bereiche mit dichtem Fellwuchs aufzutragen.

Wird der Versuch mit Feststoffen durchgeführt (die erforderlichenfalls pulverisiert werden), dann sollte die Prüfsubstanz ausreichend mit Wasser bzw. mit einem geeigneten Vehikel angefeuchtet werden, um einen guten Kontakt mit der Haut sicherzustellen. Bei der Verwendung eines Vehikels ist dessen Einfluß auf eine Reizung der Haut zu berücksichtigen. Flüssige Prüfsubstanzen werden im allgemeinen unverdünnt angewendet.

1.6.2. Versuchsbedingungen

1.6.2.1. Versuchstiere

Es können verschiedene Säugetierarten verwendet werden; jedoch ist das Albino-Kaninchen die bevorzugte Tierart.

1.6.2.2. Anzahl der Tiere

Wenn auf Grund der Ergebnisse der in-vitro-Vorversuche oder anderer Erwägungen zu vermuten ist, daß die Substanz Nekrosen verursachen (d. h. ätzend sein) könnte, sollte ein Versuch mit nur einem Tier erwogen werden. Wenn die Ergebnisse dieses Versuchs keine Ätzwirkung ergeben, sollte der Versuch mit mindestens zwei weiteren Tieren abgeschlossen werden.

Für den vollständigen Versuch sind mindestens drei gesunde erwachsene Tiere erforderlich. Es werden keine weiteren Tiere für eine unbehandelte Kontrollgruppe benötigt. Zusätzliche Tiere können zur Klärung zweifelhafter Befunde notwendig sein.

1.6.2.3. Dosierung

Sofern keine besonderen Gründe vorliegen, wird eine Dosis von 0,5 ml Flüssigkeit bzw. 0,5 g eines festen oder halbfesten Stoffes auf die vorbereitete Hautfläche aufgetragen. Angrenzende Stellen unbehandelter Haut eines jeden Tieres dienen als Kontrolle für den Versuch.

1.6.2.4. Beobachtungszeitraum

Die Dauer des Beobachtungszeitraums sollte nicht starr festgelegt werden. Sie muß ausreichend lang bemessen sein, um die Reversibilität bzw. Irreversibilität der beobachteten Wirkungen vollständig bewerten zu können. Normalerweise brauchen dafür 14 Tage nach der Applikation nicht überschritten zu werden.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Die Tiere sollen einzeln in Käfigen gehalten werden. Die Prüfsubstanz wird auf eine kleine Hautfläche (etwa 6 cm2) aufgetragen und mit einem Mulläppchen, das durch ein nicht reizendes Pflaster gehalten wird, abgedeckt. Bei Flüssigkeiten oder bestimmten Pasten kann es erforderlich sein, die Prüfsubstanz erst auf das Mulläppchen zu geben und danach auf der Haut zu fixieren. Für die Dauer der Exposition sollte das Läppchen mit einem geeigneten Okklusiv- oder Semi-Okklusiv-Verband lose auf der Haut gehalten werden. Es ist zu vermeiden, daß das Tier an den Mullverband gelangt und die Prüfsubstanz oral aufnehmen bzw. inhalieren kann.

Nach Ablauf der Expositionszeit wird die restliche Prüfsubstanz entfernt, falls möglich, mit Wasser oder einem geeigneten Lösemittel, ohne daß die vorliegende Reaktion oder die Integrität der Epidermis beeinträchtigt wird.

Die Expositionszeit beträgt normalerweise 4 Stunden.

Wenn anzunehmen ist, daß die Prüfsubstanz eine Nekrose verursachen kann (d. h. ätzend sein), so sollte die Expositionszeit verkürzt werden (z. B. auf 1 Stunde oder 3 Minuten). Ein solcher Versuch kann ggf. zunächst an nur einem Tier durchgeführt werden, dem - falls dies nicht wegen der akuten dermalen Toxizität der Prüfsubstanz ausgeschlossen ist - drei Läppchen gleichzeitig zu applizieren sind. Das erste Läppchen wird nach drei Minuten entfernt. Wenn keine schwere Hautreaktion beobachtet wird, wird das zweite Läppchen nach einer Stunde entfernt. Wenn die Beobachtungen in diesem Zeitraum darauf hindeuten, daß eine vierstuendige Exposition erforderlich ist und auf tierschutzgerechte Weise durchgeführt werden kann, wird das dritte Läppchen nach vier Stunden entfernt und die Reaktionen bewertet. In diesem Fall (d. h. wenn eine vierstuendige Exposition möglich war) sollte der Versuch dann unter Verwendung von mindestens zwei weiteren Tieren abgeschlossen werden, es sei denn, einer solchen Verfahrensweise stehen ethische Bedenken gegenüber (z. B. wenn nach der vierstuendigen Exposition eine Nekrose festgestellt wird).

Wenn entweder nach 3 Minuten oder nach einer Stunde eine schwere Hautreaktion (z. B. Nekrose) auftritt, wird der Versuch unverzueglich beendet.

Längere Expositionszeiten können unter bestimmten Voraussetzungen angezeigt sein, so z. B. durch die zu erwartende Anwendung und Exposition beim Menschen.

1.6.3.1. Beobachtung und Bewertung

Die Tiere sind auf Anzeichen von Erythem und Ödem zu beobachten, wobei die Reaktion 60 Minuten sowie 24, 48 und 72 Stunden nach Entfernen des Läppchens bewertet wird. Die Hautreaktion wird entsprechend der Skala in Tabelle 1 bestimmt und aufgezeichnet. Weitere Beobachtungen sind erforderlich, wenn die Reversibilität nicht innerhalb von 72 Stunden vollständig nachgewiesen worden ist. Neben der Beobachtung von Hautreizungen sind alle schwerwiegenden Veränderungen, wie z. B. Verätzungen (irreversible Zerstörung der Haut) und andere toxischen Wirkungen vollständig zu beschreiben.

Zur Klärung zweifelhafter Reaktionen, die durch Färbung der Haut durch die Prüfsubstanz überdeckt werden, können solche Verfahren wie z. B. die histopathologische Untersuchung oder Messung der Hautfaltendicke verwendet werden.

2. DATEN

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus muß für jedes einzelne Versuchstier der Grad der Reizung durch Beurteilung des Erythems und des Ödems während der Beobachtungszeit hervorgehen. Schwere Schädigungen, eine Bewertung des Grades und der Art der Hautreizung, der Reversibilität oder Ätzung und alle sonstigen toxischen Wirkungen sind ebenfalls aufzuzeichnen.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Tierart, Stamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter, usw.;

- Versuchsbedingungen (einschließlich der relevanten physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, des Verfahrens zur Hautvorbereitung und -reinigung und der Art des Verbandes: okklusiv oder semi-okklusiv);

- Auflistung der Art der Reizung für jedes einzelne Tier zu jedem Beobachtungszeitpunkt (1, 24, 48 und 72 Stunden usw. nach Entfernung des Mullverbandes);

- Beschreibung aller festgestellten ernsthaften Veränderungen, einschließlich Ätzung;

- Beschreibung der Stärke und der Art der festgestellten Reizung und ggf. der histopathologischen Befunde;

- Beschreibung aller weiteren toxischen Wirkungen zusätzlich zu den Hautreizungen;

- Diskussion der Ergebnisse;

- Bewertung der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

Anlage

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

B.5. AKUTE TOXIZITÄT (AUGENREIZUNG)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITIONEN

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt B).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Vorbetrachtungen

Alle verfügbaren Informationen über eine Substanz sind sorgsam in Rechnung zu stellen, um das Prüfen von Substanzen unter Bedingungen, die voraussichtlich zu starken Reaktionen führen, auf ein Minimum zu beschränken. Folgende Informationen können in dieser Hinsicht nützlich sein.

(i) Physikalisch-chemische Eigenschaften und chemische Reaktivität: Stark saure oder alkalische Prüfsubstanzen, von denen anzunehmen ist, daß sie zu einem pH-Wert im Auge von 2 oder darunter bzw. 11,5 oder darüber führen können, brauchen nicht geprüft zu werden, wenn starke Schäden vorhersehbar sind. Eine alkalische oder saure Reserve ist ebenfalls zu berücksichtigen.

(ii) Ergebnisse aus gut validierten alternativen Studien: Substanzen, die mögliche ätzende oder stark reizende Eigenschaften gezeigt haben, sollten nicht weiter auf Augenreizung geprüft werden, da davon ausgegangen werden kann, daß solche Substanzen in einem Versuch, in dem diese Methode angewendet wird, starke Wirkungen an den Augen hervorrufen können.

(iii) Ergebnisse aus Studien zur Hautreizung: Substanzen, deren ätzende oder stark hautreizende Eigenschaften in einer Studie zur Hautreizung eindeutig belegt worden sind, brauchen nicht noch speziell auf Augenreizung getestet zu werden, da davon ausgegangen werden kann, daß derartige Prüfsubstanzen starke Wirkungen an den Augen hervorrufen können.

Die Prüfsubstanz wird in einer einmaligen Dosierung bei jedem Versuchstier in eines der Augen eingebracht; das unbehandelte Auge dient als Kontrolle. Die Art der Reizung wird in bestimmten Zeitabständen gemessen, bewertet und anschließend beschrieben, um so eine vollständige Beurteilung der Wirkung vornehmen zu können. Die Beobachtungsdauer sollte so bemessen sein, daß sich die Reversibilität oder die Irreversibilität der eingetretenen Wirkung vollständig bewerten lässt.

Tiere mit starken und anhaltenden Anzeichen von Leiden und Schmerzen können vorzeitig getötet werden.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

24 Stunden vor dem Versuch werden bei jedem der ausgewählten Versuchstiere beide Augen untersucht. Tiere, bei denen bereits eine Augenreizung, okulare Defekte oder eine Schädigung der Cornea vorliegen, werden vom Versuch ausgeschlossen.

1.6.2. Versuchsbedingungen

1.6.2.1. Versuchstiere

Es können verschiedene Versuchstierarten verwendet werden, jedoch ist das gesunde erwachsene Albino-Kaninchen die bevorzugte Tierart.

1.6.2.2. Anzahl der Tiere

Ein Versuch mit nur einem Tier sollte in Erwägung gezogen werden, wenn deutliche Wirkungen vorhersehbar sind. Wenn das Ergebnis dieses Versuchs an einem Kaninchen darauf hindeutet, daß die Substanz bei Anwendung des beschriebenen Verfahrens stark reizend (reversible Wirkung) oder ätzend (irreversible Wirkung) auf die Augen wirkt, kann auf die Prüfung auf Augenreizung bei weiteren Tieren verzichtet werden. Gelegentlich kann ein weiteres Prüfen bei zusätzlichen Tieren zur Untersuchung spezieller Aspekte angezeigt sein.

Bei Versuchen mit mehr als einem Tier sind mindestens 3 Tiere zu verwenden. Weitere Tiere können zur Klärung zweifelhafter Befunde notwendig sein.

1.6.2.3. Dosierung

Bei der Prüfung von Flüssigkeiten wird eine Dosis von 0,1 ml verwendet. Bei Feststoffen, Pasten und partikelförmigen Substanzen sollte die Menge ein Volumen von 0,1 ml oder ein Gewicht von 0,1 g der zu prüfenden Substanz haben (das Gewicht muß jeweils angegeben werden). Handelt es sich um einen festen oder grobkörnigen Stoff, so ist er zu feinem Staub zu zermahlen. Das Volumen von partikelförmigen Substanzen ist erst nach vorsichtiger Kompaktierung, z. B. durch Klopfen des Meßbehälters zu bestimmen.

Bei Substanzen in Sprühdosen oder Aerosol-Druckbehältern sind während des Sprühvorganges 0,1 ml der Flüssigkeit aufzufangen und - wie für Flüssigkeiten beschrieben - in das Auge zu träufeln.

1.6.2.4. Beobachtungszeitraum

Die Dauer des Beobachtungszeitraums sollte nicht starr festgelegt werden. Sie muß ausreichend lang bemessen sein, um die Reversibilität bzw. Irreversibilität der beobachteten Wirkungen bewerten zu können. Normalerweise brauchen dafür 21 Tage nach der Applikation nicht überschritten zu werden.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Die Tiere sollen einzeln in Käfigen gehalten werden. Die Prüfsubstanz wird bei jedem Tier in den Bindehautsack eines Auges appliziert, indem man das untere Lid leicht vom Augapfel abhebt. Die Lider werden dann etwa eine Sekunde lang leicht zusammengedrückt, damit keine Substanz verlorengeht. Das andere, unbehandelte Auge dient als Kontrolle.

Wenn anzunehmen ist, daß die Substanz unverhältnismässig starke Schmerzen verursachen könnte, kann vor Applikation der Prüfsubstanz ein lokales Anästhetikum verwendet werden. Die Art, die Konzentration und der Zeitpunkt der Applikation des lokalen Anästhetikums sind sorgfältig zu wählen, um sicherzustellen, daß sich aus dessen Anwendung keine signifikanten Unterschiede in der Reaktion auf die Prüfsubstanz ergeben. Das unbehandelte Auge sollte auf ähnliche Weise anästhesiert werden.

Die Augen der Versuchstiere sollten nicht früher als 24 Stunden nach Applikation der Prüfsubstanz ausgewaschen werden. Nach 24 Stunden kann ggf. eine Augenspülung erfolgen.

Für Substanzen, die bei diesem Testverfahren eine Reizung verursachen, können zusätzliche Tests an Kaninchen angezeigt sein, bei denen diesen kurz nach Applikation der Substanz die Augen ausgewaschen werden. In solchen Fällen wird empfohlen, drei Kaninchen zu verwenden. Eine halbe Minute nach dem Einträufeln der Substanz werden die Augen der Kaninchen eine halbe Minute lang ausgewaschen, wobei Menge und Fließgeschwindigkeit so zu wählen sind, daß es zu keiner Schädigung kommt.

1.6.3.1. Beobachtung und Bewertung

Die Augen sind nach 1, 24, 48 und 72 Stunden zu untersuchen. Treten nach 72 Stunden keine Anzeichen einer Augenschädigung auf, kann der Versuch beendet werden.

Ist die Cornea in Mitleidenschaft gezogen bzw. treten weitere Reizungen an den Augen auf, ist eine längerdauernde Beobachtung erforderlich, um die Entwicklung der Veränderungen und ihrer Reversibilität bzw. Irreversibilität zu bestimmen. Neben den Beobachtungen an Cornea, Iris und Bindehaut sind auch andere festgestellte Veränderungen aufzuzeichnen und im Bericht aufzuführen. Die Stärke der Augenreaktion wird bei jeder Untersuchung entsprechend der Tabelle in der Anlage aufgezeichnet. (Die Einstufung von Augenreaktionen lässt vielfältige Interpretationsmöglichkeiten zu. Um eine Bewertung der in Testlabors oder an sonstigen Stellen durchgeführten Beobachtungen zu erleichtern, können Vergleiche mit einer illustrierten Referenztafel für Augenreizungen vorgenommen werden).

Die Untersuchung der Reaktionen kann durch die Verwendung einer Binokularlupe, einer Handspaltlampe, eines Augenmikroskops bzw. anderer geeigneter Einrichtungen erleichtert werden. Nach Aufzeichnung der Beobachtungen nach 24 Stunden können die Augen einiger bzw. aller Kaninchen ausserdem mit Fluoreszein untersucht werden.

2. DATEN

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus muß für jedes einzelne Versuchstier eine Bewertung der Stärke und der Art der Reizung sowie schwerwiegende Veränderungen und sonstige festgestellte Wirkungen (nicht nur das Auge betreffend) zu den festgelegten Beobachtungszeitpunkten hervorgehen.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Angaben zu den Tieren (Tierart, Stamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter, usw.);

- Versuchsbedingungen (einschließlich der relevanten physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz);

- Auflistung der reizenden/ätzenden Wirkungen bei den einzelnen Tieren zu den Beobachtungszeitpunkten nach 1, 24, 48 und 72 Stunden;

- Beschreibung aller festgestellten ernsthaften Veränderungen;

- ausführliche Beschreibung der Stärke und der Art der festgestellten Reizung oder Ätzung, einschließlich des betroffenen Hornhautbereiches, und Reversibilität;

- Beschreibung des Verfahrens zur Bewertung der Reizung nach 1, 24, 48 und 72 Stunden (z. B. Spaltlampe, Augenmikroskop, Fluoreszein);

- Beschreibung sonstiger festgestellter topischer Wirkungen (ausserhalb des Auges);

- Diskussion der Ergebnisse;

- Bewertung der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

Anlage

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

B.6. SENSIBILISIERUNG DER HAUT

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Bemerkungen:

Die Empfindlichkeit und Fähigkeit von Tests, potentielle Sensibilisatoren der menschlichen Haut zu ermitteln, sind von besonderer Bedeutung für ein Klassifizierungssystem der Toxizität im Bereich des öffentlichen Gesundheitswesens.

Es gibt kein alleiniges Testverfahren, das geeignet ist, alle Substanzen mit einer potentiellen Sensibilisierungswirkung auf die menschliche Haut hinreichend zu ermitteln, und das zudem für alle Substanzen relevant ist.

Bei der Auswahl eines Tests sind Faktoren wie die physikalische Beschaffenheit einer Substanz, einschließlich ihrer Fähigkeit, die Haut zu durchdringen, zu berücksichtigen.

Tests mit Meerschweinchen können unterteilt werden in Adjuvans-Tests, bei denen ein allergischer Zustand durch Auflösung oder Suspension der Prüfsubstanz im kompletten Adjuvans nach Freund (FCA) potenziert wird, und in Tests, die ohne Adjuvans arbeiten.

Die Adjuvans-Tests haben bei der Bestimmung einer wahrscheinlichen Hautsensibilisierungswirkung einer Substanz beim Menschen voraussichtlich eine grössere Vorhersagewahrscheinlichkeit als die Tests, die ohne das komplette Adjuvans nach Freund arbeiten. Sie sind daher die bevorzugten Tests.

Bei dem Maximierungstest am Meerschweinchen (GPMT) handelt es sich um ein weitverbreitetes Adjuvans-Verfahren. Obwohl es noch zahlreiche andere Verfahren gibt, mit deren Hilfe sich feststellen lässt, ob eine Substanz in der Lage ist, eine Sensibilisierungsreaktion der Haut zu bewirken, gilt der GPMT als der bevorzugte Adjuvans-Test.

Bei zahlreichen chemischen Substanzklassen gelten die ohne Adjuvans arbeitenden Tests (von denen der Bühler-Test der bevorzugte ist) als weniger empfindlich.

In bestimmten Fällen kann es gute Gründe für die Wahl des Bühler-Tests geben, bei dem die äusserliche Applikation Anwendung findet, statt der intradermalen Injektion, wie beim Maximierungstest am Meerschweinchen. Bei Anwendung des Bühler-Tests sollte eine wissenschaftliche Begründung angegeben werden.

Hier werden der Meerschweinchen-Maximierungstest (GPMT) und der Bühler-Test beschrieben. Andere Tests können angewendet werden, wenn sie gut validiert sind und eine wissenschaftliche Begründung gegeben wird.

Unabhängig von der Art des benutzen Tests muß die Empfindlichkeit des Meerschweinchenstammes, der für den Sensibilisierungstest der Haut eingesetzt wird, in regelmässigen Abständen (sechs Monate) überprüft werden. Dazu sind bekannte schwache bis mässig starke Sensibilisatoren einzusetzen, mit denen eine befriedigende Anzahl positiver Reaktionen erhalten werden muß.

Siehe auch allgemeine Einleitung - Teil B (A).

1.2. DEFINITION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (B).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Es werden folgende Substanzen, wenn notwendig verdünnt, empfohlen, ebenso aber auch alle anderen, entweder aus der Literatur bekannten Sensibilisatoren, oder solche, die der Gruppe der zu prüfenden Substanz angehören.

- p-PhenylendiaminCAS-Nr. 106-50-3

- 2,4-DinitrochlorbenzolCAS-Nr. 97-00-7

- KaliumdichromatCAS-Nr. 7778-50-9

- NeomycinsulfatCAS-Nr. 1405-10-3

- NickelsulfatCAS-Nr. 7786-81-4

1.4. PRINZIP DER METHODEN

Nach einer Anfangsexposition mit einer Prüfsubstanz ("Induktionsphase") werden die Versuchstiere annähernd zwei Wochen nach der letzten Induktionsbehandlung einer Auslösebehandlung ("challenge") ausgesetzt, um festzustellen, ob eine Überempfindlichkeit induziert wurde. Die Feststellung der Sensibilisierung erfolgt durch Untersuchung der Hautreaktion auf die Auslöseexposition ("challenge").

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODEN

1.6.1. Meerschweinchen-Maximierungstest (GPMT)

1.6.1.1. Vorbereitungen

Gesunde junge Albino-Meerschweinchen werden randomisiert und der Behandlungs- sowie der

Kontrollgruppe zugeordnet. Vor der Anwendung wird das Fell der Versuchstiere in der Schulterregion

durch Scheren oder Rasieren entfernt. Es ist darauf zu achten, daß die Haut nicht verletzt wird.

1.6.1.2. Versuchsbedingungen

1.6.1.2.1. Versuchstiere

Es werden bekannte Laborstämme des Albino-Meerschweinchens mit einem Gewicht von weniger als 500 g verwendet.

1.6.1.2.2. Anzahl und Geschlecht

Es können männliche und/oder weibliche Tiere benutzt werden. Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein. Die behandelte Gruppe besteht aus mindestens 10 Tieren, die Kontrollgruppe aus mindestens 5 Tieren. Der Einsatz einer geringeren Anzahl von Tieren ist zu begründen. Bei unklaren Ergebnissen kann eine histopathologische Untersuchung die Entscheidung der Frage erleichtern, ob der Test unter Verwendung einer neuen Gruppe von Tieren wiederholt werden soll.

Falls es nicht möglich ist, definitiv zu entscheiden, ob eine Prüfsubstanz sensibilisierend ist oder nicht, wird empfohlen die Gesamtzahl der Tiere auf mindestens 20 in der Testgruppe und 10 in der Kontrollgruppe zu erhöhen.

1.6.1.2.3. Dosierungen

Die Konzentration der Prüfsubstanz ist so einzustellen, daß sich Anzeichen einer Hautreizung zeigen, die jedoch von den Tieren in jeder Induktionsphase gut vertragen wird.

Die Auslösekonzentration ist die höchste Konzentration, die bei nicht sensibilisierten Tieren noch keine Anzeichen einer Hautreizung hervorruft.

Diese Konzentrationen können mit Hilfe einer kleinen Pilotstudie (zwei bis drei Tiere) bestimmt werden.

1.6.1.2.4. Beobachtungszeitraum

Während der Induktionsphase werden Beobachtungen durchgeführt, um mögliche Hautreizungen festzustellen. Nach der Auslöseexposition werden die Hautreaktionen 24 und 48 Stunden nach Entfernen des Läppchens bewertet.

1.6.1.3. Versuchsdurchführung

Die Tiere werden vor Beginn und nach Abschluß des Versuchs gewogen. In der Schulterregion wird das Fell entfernt. Die Durchführung des Versuchs besteht aus zwei Phasen:

1.6.1.3.1. Induktion

Tag 0 - behandelte Gruppe

Die folgenden paarweisen Injektionen von jeweils 0,1 ml werden intradermal rechts und links von der Mittellinie der Schulterregion injiziert:

Injektion 1:0,1 ml Freund's komplettes Adjuvans (FCA), mit Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung im Verhältnis 1:1 gemischt,

Injektion 2:0,1 ml Prüfsubstanz, gegebenenfalls in einem geeigneten Vehikel,

Injektion 3:0,1 ml Prüfsubstanz in FCA.

Bei der Injektion 3 werden die wasserlöslichen Substanzen in 0,05 ml Wasser und 0,05 ml unverdünntem FCA gelöst. Wenn es um die Prüfung fettlöslicher oder unlöslicher Substanzen geht, erfolgt die Mischung mit unverdünntem FCA.

Bei der Injektion 3 ist die Endkonzentration der Prüfsubstanz gleich der der Injektion 2.

Die Injektionen 1 und 2 werden dicht beieinander im Kopfbereich gesetzt, die Injektion 3 in den kaudalen Teil des Applikationsbereichs.

Tag 0 - Kontrollgruppe

Die folgenden intradermalen Injektionspaare werden an den gleichen Stellen wie oben beschrieben:

Injektion 1:0,1 ml Freund's komplettes Adjuvans (FCA), mit Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung im Verhältnis 1:1 gemischt,

Injektion 2:0,1 ml nur das Vehikel,

Injektion 3:0,1 ml Vehikel in FCA.

Tag 6 - behandelte und Kontrollgruppen

Wenn die Substanz nicht hautreizend ist, wird der Applikationsbereich nach dem Scheren und/oder Abrasieren des Fells mit 0,5 ml Natriumlaurylsulfat 10 % in Vaseline bestrichen, um eine örtliche Reizung hervorzurufen.

Tag 7 - behandelte Gruppe

Im Applikationsbereich wird erneut das Fell entfernt. Die in einem geeigneten Vehikel gelöste Prüfsubstanz (die Wahl des Vehikels ist zu begründen; Feststoffe sind fein zu pulverisieren und in einem geeigneten Vehikel zu inkorporieren; Flüssigkeiten können ggf. direkt appliziert werden) wird auf ein Filterpapier (2 cm 4 cm) aufgetragen und mit Hilfe eines Okklusivverbands für 48 Stunden auf dem Applikationsbereich fixiert.

Tag 7 - Kontrollgruppe

Im Applikationsbereich wird erneut das Fell entfernt. Das Vehikel allein wird in entsprechender Weise auf den Applikationsbereich aufgebracht und mit einem dicht schließenden Verband für 48 Stunden fixiert.

1.6.1.3.2. Auslösung

Tag 21

Die Flanken der behandelten Versuchstiere sowie der Kontrolltiere werden vom Fell befreit. Auf eine Flanke der behandelten Tiere wird ein Läppchen bzw. eine Kammer mit der Prüfsubstanz und auf die andere Flanke ein Läppchen oder eine Kammer mit dem Vehikel allein aufgebracht.

Die Läppchen werden mit einem geeigneten dicht schließenden Verband für 24 Stunden in Kontakt mit der Haut gehalten.

Die Kontrollgruppe wird in gleicher Weise behandelt.

Tage 23 und 24

- 21 Stunden nach Entfernung des Läppchens wird die behandelte Hautfläche gesäubert und ggf. von Haaren befreit;

- 3 Stunden später (48 Stunden nach Beginn der Auslösung) wird die beobachtete Hautreaktion bewertet;

- 24 Stunden nach dieser Beobachtung erfolgt eine zweite Bewertung (72 Stunden nach Beginn).

Sollte zur Klärung der Ergebnisse eine zweite Auslösung notwendig sein, so kann diese erforderlichenfalls mit einer neuen Vehikel-Kontrollgruppe etwa eine Woche später wiederholt werden.

1.6.1.3.3. Beobachtung und Bewertung

Alle Hautreaktionen und alle ungewöhnlichen Befunde bei Induktion und Auslösung sollten aufgezeichnet und berichtet werden.

Zur Klärung zweifelhafter Reaktionen oder Reaktionen, die durch die Färbung der Haut mit der Prüfsubstanz überdeckt werden, können solche Verfahren wie die histopathologische Untersuchung oder die Messung der Hautfaltendicke verwendet werden.

1.6.2. Bühler-Test

1.6.2.1. Vorbereitungen

Gesunde junge Albino-Meerschweinchen werden randomisiert und der Behandlungs- sowie der Kontrollgruppe zugeordnet. Vor der Anwendung wird das Fell der Versuchstiere an einer Flanke durch Scheren und/oder Rasieren entfernt. Es ist darauf zu achten, daß die Haut nicht verletzt wird.

1.6.2.2. Versuchsbedingungen

1.6.2.2.1. Versuchstiere

Es werden bekannte Laborstämme des Albino-Meerschweinchens mit einem Gewicht von weniger als 500 g verwendet.

1.6.2.2.2. Anzahl und Geschlecht

Es können männliche und/oder weibliche Tiere benutzt werden. Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein. Die behandelte Gruppe besteht aus mindestens 20 Tieren, die Kontrollgruppe aus mindestens 10 Tieren. Der Einsatz von weniger Tieren ist zu begründen. Bei unklaren Ergebnissen kann eine histopathologische Untersuchung die Entscheidung der Frage erleichtern, ob der Test unter Verwendung einer neuen Gruppe von Tieren wiederholt werden soll.

1.6.2.2.3. Dosierungen

Die Konzentration der Prüfsubstanz wird für jede Induktionsphase auf die höchste Dosis eingestellt, die von den Tieren systemisch noch gut vertragen wird und die im Falle reizender Substanzen bei den meisten Versuchstieren eine leichte bis mässige Reizung verursacht. Die Auslösekonzentration ist die höchste Konzentration, die bei nicht sensibilisierten Tieren keine Anzeichen einer Hautreizung hervorruft. Diese Konzentrationen können mit Hilfe einer kleinen Pilotstudie (zwei bis drei Tiere) bestimmt werden.

1.6.2.2.4. Beobachtungszeitraum

Während der Induktionsphase werden Beobachtungen durchgeführt, um Hautreizungen festzustellen. Nach der Auslöseexposition werden die Hautreaktionen 24 und 48 Stunden nach Entfernen des Läppchens (d. h. 30 bzw. 54 Stunden nach Beginn der Applikation) bewertet.

1.6.2.3. Versuchsdurchführung

Die Tiere werden vor Beginn und nach Abschluß des Versuchs gewogen.

Die Durchführung des Versuchs besteht aus zwei Phasen:

1.6.2.3.1. Induktion

Tag 0 - behandelte Gruppe

An einer Flanke wird das Fell entfernt (geschoren oder abrasiert). 0,5 ml der in einem geeigneten Vehikel gelösten Prüfsubstanz (die Wahl des Vehikels ist zu begründen; Flüssigkeiten können ggf. direkt appliziert werden) werden auf ein Baumwollkissen aufgetragen. Es wird auf den Testbereich appliziert und mit Hilfe eines okklusiven Läppchens oder einer Kammer und einem geeigneten Verband über einen Zeitraum von 6 Stunden mit der Haut in Kontakt gehalten.

Tag 0 - Kontrollgruppe

An einer Flanke wird das Fell entfernt (geschoren oder abrasiert). Das Vehikel allein wird in entsprechender Weise auf den Applikationsbereich aufgebracht. Es wird mit Hilfe eines okklusiven Läppchens oder einer Kammer und einem geeignetem Verband über einen Zeitraum von 6 Stunden in Kontakt mit der Haut gehalten.

Tage 7 und 14

An den Tagen 7 und 14 wird die gleiche Applikation wie am Tag 0 in demselben Applikationsbereich vorgenommen (wenn erforderlich, nach Entfernen des Fells).

1.6.2.3.2. Auslösung

Tag 28

An der anderen Flanke der behandelten wie der Kontrolltiere wird das Fell entfernt (geschoren oder abrasiert). Ein Okklusivläppchen oder eine Kammer werden mit 0,5 ml der Prüfsubstanz in der höchsten nicht reizenden Konzentration auf die hintere Flanke der behandelten Tiere aufgetragen.

Auf die vordere Flanke wird ebenfalls ein Okklusivläppchen oder eine Kammer mit dem Vehikel allein aufgetragen.

Die Läppchen werden mit Hilfe eines geeigneten Verbands für 6 Stunden in Kontakt mit der Haut gehalten.

Die Kontrollgruppe wird in gleicher Weise behandelt.

Tage 29 und 30

- 21 Stunden nach Entfernung des Läppchens wird die behandelte Hautfläche gesäubert und ggf. von Haaren befreit;

- 3 Stunden später (30 Stunden nach Beginn der Auslösung) wird die beobachtete Hautreaktion bewertet;

- 24 Stunden nach dieser Beobachtung erfolgt eine zweite Bewertung (54 Stunden nach Beginn).

1.6.2.3.3. Beobachtung und Bewertung

Alle Hautreaktionen und alle ungewöhnlichen Befunde bei Induktion und Auslösung sollten berichtet werden.

Zur Klärung zweifelhafter Reaktionen oder Reaktionen, die durch die Färbung der Haut mit der Prüfsubstanz überdeckt werden, können solche Verfahren wie die histopathologische Untersuchung oder die Messung der Hautfaltendicke verwendet werden.

2. DATEN (GPMT- und Bühler-Test)

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus muß für jedes Versuchstier die Hautreaktion zu jedem einzelnen Beobachtungszeitpunkt hervorgehen.

3. ABSCHLUSSBERICHT (GPMT- und Bühler-Test)

3.1. PRÜFBERICHT (GPMT- und Bühler-Test)

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- verwendeter Meerschweinchenstamm;

- Versuchsbedingungen, bei Induktion und Auslösung verwendete Vehikel- und Prüfsubstanzkonzentrationen;

- Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere;

- Einzelgewicht der Tiere bei Beginn und bei Abschluß des Versuchs;

- alle an den einzelnen Tieren beobachteten Reaktionen, einschließlich Beschreibung des Bewertungssystems (sofern angewendet);

- Diskussion der Ergebnisse;

- Bewertung der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION (GPMT- und Bühler-Test)

siehe allgemeine Einleitung - Teil B (D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (E).

B.7. TOXIZITÄT NACH 28-TAEGIGER GABE (ORAL)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITIONEN

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt B).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Die Prüfsubstanz wird täglich in abgestuften Dosen mehreren Versuchstiergruppen oral verabreicht, und zwar eine Dosierung je Gruppe über einen Zeitraum von 28 Tagen. Während des Versuchszeitraums werden die Tiere täglich beobachtet, um Symptome toxischer Wirkungen festzustellen. Tiere, die während des Versuchs sterben, sowie bei Versuchsende überlebende Tiere werden seziert.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

Die Tiere werden vor Versuchsbeginn für einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen unter experimentellen Haltungs- oder Fütterungsbedingungen eingewöhnt. Vor dem Versuch werden gesunde junge Tiere randomisiert und den einzelnen Behandlungsgruppen zugeordnet. Die Prüfsubstanz kann im Futter, mit der Schlundsonde, in Kapseln oder im Trinkwasser verabreicht werden. Bei allen Tieren sollte während des gesamten Versuchszeitraums die Prüfsubstanz nach der gleichen Methode verabreicht werden. Wird der Prüfsubstanz zur Vereinfachung der Verabreichung ein Vehikel oder ein sonstiger Zusatz beigegeben, muß dessen nichttoxische Wirkung gesichert sein. Dazu können ggf. Daten aus früheren Versuchen herangezogen werden.

1.6.2. Versuchsbedingungen

1.6.2.1. Versuchstiere

Sofern nicht besondere Gründe vorliegen, sollten die Versuche mit Ratten durchgeführt werden. Es sind gesunde junge Tiere bekannter Versuchstierstämme zu verwenden; bei Versuchsbeginn sollten die Ratten - falls möglich - weniger als 6 Wochen, in keinem Fall jedoch über 8 Wochen alt sein.

Die Schwankung im Körpergewicht der Tiere des jeweiligen Versuchs sollte zu Beginn des Versuchs nicht mehr als 20 % vom Mittelwert betragen.

1.6.2.2. Anzahl und Geschlecht

Mindestens 10 Tiere (5 weibliche und 5 männliche) sind für jede Dosierung zu verwenden. Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein. Sollen im Verlauf des Versuchs Tiere getötet werden, so muß die Gesamtzahl der Tiere um die Zahl an Tieren erhöht werden, die schon vor Versuchsende getötet werden sollen. Darüber hinaus kann eine zusätzliche Gruppe (Satellitengruppe) von 10 Tieren (5 Tiere pro Geschlecht) über 28 Tage mit der höchsten Dosierung behandelt werden. Während der darauf folgenden behandlungsfreien 14 Tage wird auf Reversibilität, Fortbestehen oder verzögertes Auftreten toxischer Wirkungen geachtet. Eine Satellitengruppe von 10 Kontrolltieren (5 Tiere pro Geschlecht) wird ebenfalls verwendet.

1.6.2.3. Dosierungen

Es sind mindestens drei Dosierungs- und eine Kontrollgruppe zu wählen. Abgesehen von der Applikation der Prüfsubstanz sind die Tiere der Kontrollgruppe genauso zu behandeln wie die Versuchstiere. Wird zur Vereinfachung der Applikation ein Vehikel benutzt, so wird der Kontrollgruppe das Vehikel in gleicher Weise verabreicht wie den behandelten Tieren, und zwar in der Menge, die die Gruppe mit der höchsten Dosierung erhält. Die höchste Dosierung muß so gewählt werden, daß auf jeden Fall toxische Effekte auftreten, die Tiere jedoch nicht oder nur in geringer Zahl sterben. Die niedrigste Dosierung darf keine Anzeichen von Toxizität hervorrufen. Liegen brauchbare Schätzungen über die Höhe der Exposition beim Menschen vor, so muß die niedrigste Dosierung diesen Wert überschreiten. Nach Möglichkeit sollte die mittlere Dosierung nur geringe feststellbare toxische Effekte verursachen. Werden mehrere Zwischendosierungen verabreicht, so sollten diese so gewählt werden, daß es zu einer graduellen Abstufung der toxischen Wirkungen kommt. In den Gruppen mit niedriger und mittlerer Dosierung sowie in den Kontrollgruppen sollte die Anzahl der Todesfälle gering sein, um eine aussagekräftige Bewertung der Ergebnisse zu ermöglichen.

Wird die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht, so ist entweder eine konstante Konzentration (ppm oder mg/kg) im Futter oder eine konstante Dosierung in Relation zum Körpergewicht der Tiere zu wählen; jede Abweichung von diesem Schema ist zu begründen. Wird die Substanz mit der Schlundsonde verabreicht, sollte dies täglich zur gleichen Zeit erfolgen. Die Dosierungen sollten in regelmässigen Zeitabständen (wöchentlich oder zweimal wöchentlich) so angepasst werden, daß in Relation zum Körpergewicht der Tiere ein konstantes Dosierungsniveau erhalten bleibt.

1.6.2.4. Limit-Test

Wird ein 28-Tage-Test nach dem nachfolgend beschriebenen Verfahren durchgeführt und verursacht die Verabreichung einer Dosis von 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag bzw. einer höheren Dosis, die einer möglichen Exposition beim Menschen (soweit bekannt) entspricht, keine toxischen Effekte, so kann auf eine weitere Prüfung verzichtet werden. Wird eine Prüfsubstanz mit geringer Toxizität mit dem Futter verabreicht, so muß sichergestellt sein, daß weder die zugeführte Menge noch sonstige Eigenschaften der Prüfsubstanz die normalen Ernährungsbedingungen der Tiere beeinträchtigen.

1.6.2.5. Beobachtungszeitraum

Alle Tiere sind täglich zu beobachten und Symptome einer toxischen Wirkung, deren zeitliches Auftreten sowie Grad und Dauer sind aufzuzeichnen. Der Eintritt des Todes und der Zeitpunkt, zu dem Symptome auftreten und/oder wieder abklingen, sind festzuhalten.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Die Tiere erhalten die Prüfsubstanz normalerweise an 7 Tagen pro Woche über einen Zeitraum von 28 Tagen. Tiere einer Satellitengruppe, die für eine Nachfolgebeobachtung vorgesehen sind, sollten für weitere 14 Tage ohne Behandlung gehalten werden, um die Reversibilität von toxischen Effekten bzw. deren Fortbestehen festzustellen.

Die Beobachtungen der Tiere sollten sich insbesondere auf Veränderungen an Haut, Fell, Augen, Schleimhäuten, Atmung, Kreislauf, autonomem und zentralem Nervensystem sowie an der Somatomotorik und am Verhaltensmuster erstrecken. Die Futteraufnahme (und die Wasseraufnahme bei Verabreichung der Prüfsubstanz im Trinkwasser) und das Gewicht der Tiere werden wöchentlich bestimmt.

Eine regelmässige Beobachtung der Tiere ist erforderlich, um so weit wie möglich sicherzustellen, daß Tiere während des Versuchs nicht durch Kannibalismus, Autolyse der Gewebe oder Fehler beim Umsetzen verlorengehen. Nach Abschluß des Versuchs werden alle überlebenden Tiere mit Ausnahme der Satellitengruppe seziert. Moribunde Tiere sowie Tiere, bei denen Anzeichen von starken Leiden und Schmerzen festgestellt werden, sollten daraufhin sofort ausgesondert, unter Verwendung einer tierschutzgerechten Methode getötet und seziert werden.

Am Ende des Versuchs werden alle Tiere, einschließlich der Kontrolltiere, folgenden Untersuchungen unterzogen:

1. Die Hämatologie sollte mindestens die Bestimmung des Hämatokritwertes und der Hämoglobinkonzentration, der Erythrozytenzahl, der Gesamt- und Differential-Leukozytenzahl sowie die Messung der Gerinnungsfähigkeit umfassen.

2. Klinisch-biochemische Analyse des Blutes; einschließlich wenigstens eines Parameters der Leber- und Nierenfunktion: Alanin-Aminotransferase (früher bekannt als Serum-Glutamat-Pyruvat-Transaminase), Aspartat-Aminotransferase (früher bekannt als Serum-Glutamat-Oxalazetat-Transaminase), Harnstoff-Stickstoff, Albumin, Kreatinin, Gesamt-Bilirubin und Gesamt-Serum-Protein.

Bestimmungen weiterer blutchemischer Parameter, die ggf. für eine adäquate toxikologische Bewertung erforderlich sind, umfassen: Kalzium, Phosphor, Chlorid, Natrium, Kalium, Nüchternglukose, Lipide, Hormone, Säuren-Basen-Gleichgewicht, Methämoglobin, Cholinesteraseaktivität.

Zusätzliche klinisch-biochemische Analysen können ggf. notwendig sein, um die Untersuchung der beobachteten Effekte zu vertiefen.

1.6.3.1. Autopsie

An allen am Versuch beteiligten Tieren wird eine vollständige Autopsie vorgenommen. Zumindest die Leber, die Nieren, die Nebennieren und die Hoden werden sobald wie möglich nach der Sektion feucht gewogen, um ein Austrocknen zu verhindern. Organe und Gewebe (Leber, Niere, Milz, Hoden, Nebennieren, Herz sowie alle Organe mit makroskopischen Veränderungen bzw. Grössenveränderungen) sind im Hinblick auf mögliche spätere histopathologische Untersuchungen in einem geeigneten Medium aufzubewahren.

1.6.3.2. Histopathologische Untersuchung

Bei allen Tieren der Gruppe mit der höchsten Dosierung sowie bei den Tieren der Kontrollgruppe ist eine histologische Untersuchung der konservierten Organe und Gewebe durchzuführen. Alle Organe und Gewebe, die in der Gruppe mit der höchsten Dosierung prüfsubstanzbedingte Schädigungen aufweisen, müssen auch bei allen anderen Gruppen mit geringerer Dosierung untersucht werden. Bei den Tieren der Satellitengruppe sind jene Organe und Gewebe mit besonderer Aufmerksamkeit zu untersuchen, bei denen in den behandelten Gruppen toxische Wirkungen auftraten.

2. DATEN

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus muß für jede Dosisgruppe und Kontrollgruppe die Anzahl der Tiere zu Beginn des Versuchs und die Anzahl der Tiere mit den einzelnen Schädigungsformen zu entnehmen sein.

Alle ermittelten Ergebnisse sind durch ein geeignetes statistisches Verfahren zu bewerten. Dazu kann jede anerkannte statistische Methode herangezogen werden.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Tierart, Stamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter, usw.;

- Versuchsbedingungen;

- Dosierungen (ggf. Vehikel) und Konzentrationen;

- Daten über toxische Reaktionen, nach Geschlecht und Dosierung;

- No-effect level (NEL), sofern bestimmbar;

- Zeitpunkt des Todes während des Versuchs bzw. Angabe, ob die Tiere den Versuch überlebten;

- toxische bzw. andere Wirkungen;

- Zeitpunkt der Feststellung der einzelnen Zeichen einer toxischen Wirkung und deren weiterer Verlauf;

- Angaben über Futterverbrauch und Körpergewichtsverlauf;

- hämatologische Tests und deren vollständige Ergebnisse;

- klinisch-biochemische Tests und deren vollständige Ergebnisse;

- Sektionsbefunde;

- detaillierte Beschreibung der histopathologischen Befunde;

- statistische Auswertung der Ergebnisse, sofern möglich;

- Diskussion der Ergebnisse;

- Bewertung der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

B.8. TOXIZITÄT NACH 28-TAEGIGER GABE (INHALATION)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Es ist vorteilhaft, vorher Angaben zur Partikelgrössenverteilung, zum Dampfdruck, Schmelzpunkt, Siedepunkt, Flammpunkt und zur Explosivität (falls zutreffend) der Substanz zu haben.

Siehe auch allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt B).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Mehrere Versuchstiergruppen werden täglich über einen bestimmten Zeitraum der Prüfsubstanz in abgestuften Konzentrationen für 28 Tage ausgesetzt, wobei eine Konzentration für jede Gruppe verwendet wird. Wird ein Vehikel herangezogen, um eine geeignete Konzentration der Prüfsubstanz in der Atmosphäre herzustellen, ist eine Vehikel-Kontrollgruppe einzusetzen. Während des Versuchszeitraums werden die Tiere täglich beobachtet, um Symptome toxischer Wirkungen festzustellen. Tiere, die während des Versuchs sterben, und die bei Versuchsende überlebenden Tiere werden seziert.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

Die Tiere werden vor Versuchsbeginn für einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen unter experimentellen Haltungs- oder Fütterungsbedingungen eingewöhnt. Vor dem Versuch werden gesunde junge Tiere randomisiert und der erforderlichen Zahl von Gruppen zugeordnet. Falls notwendig kann der Prüfsubstanz ein geeignetes Vehikel beigegeben werden, um die gewünschte Konzentration der Prüfsubstanz in der Atmosphäre herzustellen. Wird zur Vereinfachung der Verabreichung ein Vehikel oder ein sonstiger Zusatz verwendet, muß dessen nichttoxische Wirkung gesichert sein. Dazu können ggf. Daten aus früheren Versuchen herangezogen werden.

1.6.2. Versuchsbedingungen

1.6.2.1. Versuchstiere

Sofern nicht besondere Gründe vorliegen, sollten die Versuche mit Ratten durchgeführt werden. Es sind gesunde junge Tiere bekannter Versuchstierstämme zu verwenden.

Die Schwankung im Körpergewicht der Tiere des jeweiligen Versuchs sollte zu Beginn des Versuchs nicht mehr als 20 % vom entsprechenden Mittelwert betragen.

1.6.2.2. Anzahl und Geschlecht

Mindestens 10 Tiere (5 weibliche und 5 männliche) sind für jede Testkonzentration zu verwenden. Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein. Sollen im Verlauf des Versuchs Tiere getötet werden, so muß die Gesamtzahl der Tiere um die Zahl an Tieren erhöht werden, die schon vor Versuchsende getötet werden sollen. Darüber hinaus kann eine zusätzliche Gruppe (Satellitengruppe) von 10 Tieren (5 Tiere pro Geschlecht) über 28 Tage mit der höchsten Konzentration exponiert werden. Während der darauffolgenden behandlungsfreien 14 Tage wird auf Reversibilität, Fortbestehen oder verzögertes Auftreten toxischer Wirkungen geachtet. Eine Satellitengruppe von 10 Kontrolltieren (5 Tiere pro Geschlecht) wird ebenfalls verwendet.

1.6.2.3. Expositionskonzentrationen

Es sind mindestens drei Konzentrationen sowie eine Kontrollgruppe oder - sofern ein Vehikel benutzt wurde - eine Vehikel-Kontrollgruppe (entsprechend der Konzentration des Vehikels bei der höchsten Expositionskonzentration) zu wählen. Abgesehen von der Exposition mit der Prüfsubstanz sind die Tiere der Kontrollgruppe genauso zu behandeln wie die Versuchstiere. Die höchste Konzentration sollte so gewählt werden, daß auf jeden Fall toxische Effekte auftreten, die Tiere jedoch nicht oder nur in geringer Zahl sterben. Die niedrigste Dosierung darf keine Anzeichen von Toxizität hervorrufen. Liegen brauchbare Schätzungen über die Höhe der Exposition beim Menschen vor, so sollte die niedrigste Konzentration diesen Wert überschreiten. Nach Möglichkeit sollte die mittlere Konzentration nur geringe feststellbare toxische Effekte verursachen. Werden mehrere Zwischenkonzentrationen verabreicht, so sollten sie so gewählt werden, daß es zu einer graduellen Abstufung der toxischen Wirkungen kommt. In den Gruppen mit niedriger und mittlerer Konzentration sowie in den Kontrollgruppen sollte die Anzahl der Todesfälle gering sein, um eine aussagekräftige Bewertung der Ergebnisse zu ermöglichen.

1.6.2.4. Expositionszeit

Die tägliche Expositionszeit sollte 6 Stunden betragen; aufgrund spezifischer Erfordernisse können sich ggf. andere Zeiten als notwendig erweisen.

1.6.2.5. Ausrüstung

Für die Tierversuche sollte eine Inhalationsanlage benutzt werden, die einen dynamischen Luftstrom mit einem Luftwechsel von mindestens 12 mal pro Stunde ermöglicht, um einen adäquaten Sauerstoffgehalt und eine gleichmässig verteilte Expositionsatmosphäre zu gewährleisten. Wird eine Kammer verwendet, so ist sie so zu gestalten, daß die Versuchstiere möglichst wenig zusammengedrängt werden und die Exposition durch Inhalation der Prüfsubstanz maximiert wird. Um die Stabilität der Atmosphäre in der Inhalationskammer sicherzustellen, sollte grundsätzlich das "Gesamtvolumen" der Versuchstiere 5 % des Kammervolumens nicht überschreiten. Es sind Expositionen des oronasalen Bereichs, des Kopfes oder des ganzen Körpers in Inhalationskammern zu verwenden; die beiden ersten Expositionsarten dienen dazu, die Aufnahme der Prüfsubstanz auf anderen Wegen einzuschränken.

1.6.2.6. Beobachtungszeitraum

Die Versuchstiere sind während des gesamten Behandlungszeitraumes und der behandlungsfreien Phase täglich auf Symptome toxischer Wirkungen zu beobachten. Der Eintritt des Todes und der Zeitpunkt, zu dem Symptome auftreten und/oder wieder abklingen, sind festzuhalten.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Die Tiere werden der Prüfsubstanz täglich an 5-7 Tagen pro Woche über einen Zeitraum von 28 Tagen ausgesetzt. Die Tiere einer Satellitengruppe, die für eine Nachbeobachtung vorgesehen sind, sollten für weitere 14 Tage ohne Exposition gehalten werden, um die Reversibilität von toxischen Effekten bzw. deren Fortbestehen festzustellen. Die Temperatur soll während des Versuchs 22 C 3 C betragen.

Die relative Feuchtigkeit soll zwischen 30 % und 70 % liegen, ausgenommen in den Fällen, wo dies nicht durchführbar ist (z. B. Versuche mit bestimmten Aerosolen). Die Aufrechterhaltung eines leichten Unterdrucks in der Kammer (≤ 5 mm Wasser) verhindert ein Entweichen der Prüfsubstanz in die Umgebung. Während der Exposition werden weder Futter noch Wasser verabreicht.

Es soll ein dynamisches Inhalationssystem mit einem geeigneten analytischen Verfahren zur Bestimmung der Konzentration benutzt werden. Um brauchbare Expositionskonzentrationen zu erhalten, wird ein Vorversuch empfohlen. Die Luftdurchflußrate ist so einzustellen, daß die Bedingungen in der gesamten Expositionskammer einheitlich sind. Das System soll gewährleisten, daß konstante Expositionsbedingungen so schnell wie möglich erreicht werden.

Die folgenden Messungen oder Überwachungen sollten durchgeführt werden:

a) Messung der Luftdurchflußrate (kontinuierlich)

b) Die tatsächliche Konzentration der Prüfsubstanz wird im Atembereich gemessen. Während der täglichen Expositionsdauer darf die Konzentration nicht mehr als 15 % vom Mittelwert abweichen. Bei einigen Aerosolen ist dieses Prüfniveau möglicherweise nicht erreichbar. In diesem Fall wird ein grösserer Streubereich akzeptiert. Während der gesamten Versuchsdauer ist die Konzentration von Tag zu Tag so konstant wie möglich zu halten. Für Aerosole ist mindestens einmal pro Woche eine Analyse der Partikelgrösse für jede Versuchsgruppe durchzuführen.

c) Temperatur und Luftfeuchtigkeit (wenn möglich kontinuierlich).

Während und nach der Exposition werden die Tiere beobachtet und die Befunde für jedes Tier aufgezeichnet. Alle Tiere sollen täglich beobachtet und Zeichen toxischer Wirkungen aufgezeichnet werden, darunter der Zeitpunkt des Auftretens sowie Grad und Dauer. Die Beobachtungen der Tiere sollten sich insbesondere auf Veränderungen an Haut, Fell, Augen und Schleimhäuten, Atmung, Kreislauf, autonomem und zentralem Nervensystem sowie an der Somatomotorik und am Verhaltensmuster erstrecken. Futteraufnahme und Gewicht der Tiere sind wöchentlich zu bestimmen. Eine regelmässige Beobachtung der Tiere ist erforderlich, um so weit wie möglich sicherzustellen, daß Tiere während des Versuchs nicht durch Kannibalismus, Autolyse der Gewebe oder Fehler beim Umsetzen verloren gehen. Nach Abschluß des Versuchszeitraumes werden alle überlebenden Tiere mit Ausnahme der Satellitengruppe seziert. Sterbende Tiere sowie Tiere, bei denen Anzeichen von starkem Leiden und Schmerzen festgestellt werden, sollten daraufhin sofort ausgesondert und unter Verwendung einer tierschutzgerechten Methode getötet und seziert werden.

Am Ende des Versuchs werden alle Tiere, einschließlich der Kontrolltiere, folgenden Untersuchungen unterzogen:

(i) Die Hämatologie sollte mindestens die Bestimmung des Hämatokritwertes und der Hämoglobinkonzentration, der Erythrozytenzahl, der Gesamt- und Differential-Leukozytenzahl sowie die Messung der Gerinnungsfähigkeit umfassen.

(ii) Klinisch-biochemische Analyse des Blutes: Zur Beurteilung der Leber- und Nierenfunktion sollte zumindest je einer der folgenden Parameter bestimmt werden: Alanin-Aminotransferase (früher bekannt als Serum-Pyruvat-Transaminase), Aspartat-Aminotransferase (früher bekannt als Serum-Glutamat-Oxalazetat-Transaminase), Harnstoff-Stickstoff, Albumin, Kreatinin, Gesamt-Bilirubin und Gesamt-Serum-Protein.

Bestimmungen weiterer blutchemischer Parameter, die ggf. für eine adäquate toxikologische Bewertung erforderlich sind, umfassen: Kalzium, Phosphor, Chlorid, Natrium, Kalium, Nüchternglukose, Lipide, Hormone, Säuren-Basen-Gleichgewicht, Methämoglobin, Cholinesteraseaktivität.

Zusätzliche klinisch-biochemische Analysen können ggf. notwendig sein, um die Untersuchung der beobachteten Effekte zu vertiefen.

1.6.3.1. Autopsie

An allen am Versuch beteiligten Tieren wird eine vollständige Autopsie vorgenommen. Zumindest die Leber, die Nieren, die Nebennieren, die Lunge und die Hoden werden sobald wie möglich nach der Sektion feucht gewogen, um ein Austrocknen zu verhindern. Organe und Gewebe (Atemtrakt, Leber, Niere, Milz, Hoden, Nebennieren, Herz sowie alle Organe mit makroskopischen Veränderungen bzw. Grössenveränderungen) sind im Hinblick auf spätere histopathologische Untersuchungen in einem geeigneten Medium aufzubewahren. Die Lungen sind in intaktem Zustand zu entfernen, zu wiegen und mit einem geeigneten Fixativ zu behandeln, um die Lungenstruktur zu erhalten.

1.6.3.2. Histopathologische Untersuchung

Bei allen Tieren der Gruppe mit der höchsten Dosierung sowie bei den Tieren der Kontrollgruppe(n) ist eine histologische Untersuchung der konservierten Organe und Gewebe durchzuführen. Alle Organe und Gewebe, die in der Gruppe mit der höchsten Dosierung prüfsubstanzbedingte Schädigungen aufweisen, müssen auch bei allen anderen Gruppen bei geringerer Dosierung untersucht werden. Bei den Tieren der Satellitengruppe sind jene Organe und Gewebe mit besonderer Aufmerksamkeit zu untersuchen, bei denen in den anderen behandelten Gruppen toxische Effekte auftraten.

2. DATEN

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus müssen für jede Dosisgruppe und Kontrollgruppe die Anzahl der Tiere zu Beginn des Versuchs und die Anzahl der Tiere mit den einzelnen Schädigungsformen zu entnehmen sein.

Alle ermittelten Ergebnisse sind durch ein geeignetes statistisches Verfahren zu bewerten. Dazu kann jede anerkannte statistische Methode herangezogen werden.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Tierart, Stamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;

- Versuchsbedingungen;

Beschreibung des Expositionsapparates einschließlich Gestaltung, Typ, Abmessungen, Luftquelle, System zur Aerosolerzeugung, Klimatisierungssystem, Behandlung der Abluft und ggf. Art der Unterbringung der Tiere in einer Versuchskammer. Die Geräte zur Messung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und ggf. der Konstanz der Aerosolkonzentration oder Teilchengrössenverteilung sind zu beschreiben.

Expositionsdaten:

Diese Daten sind in tabellarischer Form zusammenzustellen und unter Angabe von Mittelwerten und Berücksichtigung der Schwankungen (z. B. Standardabweichung) darzustellen. Sie sollen, wenn möglich, folgende Angaben enthalten:

a) Luftdurchflußrate in der Inhalationsanlage;

b) Temperatur und Luftfeuchtigkeit;

c) nominale Konzentration (Gesamtmenge der Prüfsubstanz, die in die Inhalationsanlage eingegeben wurde, dividiert durch das Luftvolumen);

d) ggf. die Art des Vehikels;

e) tatsächliche Konzentrationen im Atembereich;

f) der mittlere ärodynamische Massendurchmesser (Maß Median Ärodynamic Diameter - MMAD) und die geometrische Standardabweichung (Geometric Standard Deviation - GSD);

- Daten über toxische Reaktionen, nach Geschlecht und Konzentration;

- Zeitpunkt des Todes während des Versuchs bzw. Angabe, ob die Tiere den Versuch überlebten;

- toxische bzw. andere Wirkungen; no-effect level (NEL);

- Zeitpunkt der Beobachtung der einzelnen Zeichen einer toxischen Wirkung und deren weiterer Verlauf;

- Angaben über Fütterung und Körpergewicht;

- hämatologische Tests und deren Ergebnisse;

- klinisch-biochemische Tests und deren Ergebnisse;

- Sektionsbefunde;

- detaillierte Beschreibung der histopathologischen Befunde;

- statistische Auswertung der Ergebnisse, sofern möglich;

- Diskussion der Ergebnisse;

- Bewertung der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

B.9. TOXIZITÄT NACH 28-TAEGIGER GABE (DERMAL)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITIONEN

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt B).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Die Prüfsubstanz wird täglich in abgestuften Dosen mehreren Versuchstiergruppen auf die Haut aufgetragen, und zwar eine Dosierung je Gruppe über einen Zeitraum von 28 Tagen. Während des Versuchszeitraums werden die Tiere täglich beobachtet, um Symptome toxischer Wirkungen festzustellen. Tiere, die während des Versuchs sterben, sowie bei Versuchsende überlebende Tiere werden seziert.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

Die Tiere werden vor Versuchsbeginn für einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen unter experimentellen Haltungs- oder Fütterungsbedingungen eingewöhnt. Vor dem Versuch werden gesunde junge Tiere randomisiert und den einzelnen Behandlungs- und Kontrollgruppen zugeordnet. Kurz vor Versuchsbeginn wird das Fell auf dem Rücken der Versuchstiere geschoren. Ein Abrasieren des Fells ist ebenfalls möglich, sollte jedoch 24 Stunden vor dem Versuch erfolgen. Das Scheren oder Rasieren muß normalerweise wöchentlich wiederholt werden. Es ist darauf zu achten, daß dabei die Haut nicht verletzt wird. Mindestens 10 % der Körperoberfläche wird für die Applikation vorbereitet. Bei der Bestimmung des zu scherenden Bereichs und der Applikationsfläche ist das Gewicht der Tiere zu berücksichtigen. Werden feste Stoffe verwendet, die gegebenenfalls pulverisiert werden können, sollte die Prüfsubstanz ausreichend mit Wasser oder ggf. in anderer geeigneter Form angefeuchtet werden, um einen guten Kontakt mit der Haut sicherzustellen. Flüssige Prüfsubstanzen werden im allgemeinen unverdünnt angewendet. Die Applikation erfolgt täglich an 5 bis 7 Tagen pro Woche.

1.6.2. Versuchsbedingungen

1.6.2.1. Versuchstiere

Es können geschlechtsreife Ratten oder Kaninchen verwendet werden. Auch andere Tierarten können verwendet werden, jedoch muß ihre Verwendung begründet werden.

Die Schwankung des Körpergewichts der Tiere des jeweiligen Versuchs sollte bei Versuchsbeginn nicht mehr als 20 % vom entsprechenden Mittelwert betragen.

1.6.2.2. Anzahl und Geschlecht

Mindestens 10 Tiere (5 weibliche und 5 männliche) mit gesunder unbeschädigter Haut sind für jede Dosierung zu verwenden. Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein. Sollen im Verlauf des Versuchs Tiere getötet werden, so muß die Gesamtzahl der Tiere um die Zahl an Tieren erhöht werden, die schon vor Versuchsende getötet werden sollen. Darüber hinaus kann eine zusätzliche Gruppe (Satellitengruppe) von 10 Tieren (5 Tiere pro Geschlecht) über 28 Tage mit der höchsten Dosierung behandelt werden. Während der darauffolgenden behandlungsfreien 14 Tage wird auf Reversibilität, Fortbestehen oder verzögertes Auftreten toxischer Wirkungen geachtet. Eine Satellitengruppe von 10 Kontrolltieren (5 Tiere pro Geschlecht) wird ebenfalls verwendet.

1.6.2.3. Dosierungen

Es sind mindestens drei Dosierungen sowie eine Kontrollgruppe oder - sofern ein Vehikel benutzt wurde - eine Vehikel-Kontrollgruppe zu wählen. Die Einwirkungszeit sollte mindestens 6 Stunden pro Tag betragen. Die Applikation der Prüfsubstanz sollte täglich zur gleichen Zeit erfolgen. Eine Anpassung der Dosierung an das Körpergewicht ist in festgesetzten Intervallen (wöchentlich oder zweimal wöchentlich) vorzunehmen, um in Relation zum Körpergewicht des Tieres ein konstantes Dosierungsniveau zu erhalten. Abgesehen von der Applikation der Prüfsubstanz sind die Tiere der Kontrollgruppe genauso zu behandeln wie die Versuchstiere. Wird zur Erleichterung der Applikation ein Vehikel benutzt, so wird der Kontrollgruppe das Vehikel in gleicher Weise verabreicht wie den behandelten Tieren, und zwar in der Menge, die die Gruppe mit der höchsten Dosierung erhält. Die höchste Dosierung sollte so gewählt werden, daß auf jeden Fall toxische Effekte auftreten, die

Tiere jedoch nicht oder nur in geringer Zahl sterben. Die niedrigste Dosierung sollte keine Anzeichen von Toxizität hervorrufen. Liegen brauchbare Schätzungen über die Höhe der Exposition beim Menschen vor, so sollte die niedrigste Dosis diesen Wert überschreiten. Nach Möglichkeit sollte die mittlere Dosierung nur geringe toxische Effekte verursachen. Werden mehrere Zwischendosierungen verabreicht, so sollten sie so gewählt werden, daß es zu einer graduellen Abstufung der toxischen Wirkungen kommt. In den Gruppen mit niedriger oder mittlerer Dosierung sowie in den Kontrollgruppen sollte die Anzahl der Todesfälle gering sein, um eine aussagekräftige Bewertung der Ergebnisse zu ermöglichen.

Führt die Applikation der Prüfsubstanz zu schweren Hautreizungen, sollte die Konzentration herabgesetzt werden, was bei hoher Dosierung zu einer Verminderung oder einem Ausbleiben sonstiger toxischer Wirkungen führen könnte. Wurde überdies die Haut stark beschädigt, ist es u. U. notwendig, den Versuch abzubrechen und mit einer geringeren Konzentration erneut durchzuführen.

1.6.2.4. Limit-Test

Verursacht bei Durchführung einer Vorstudie die Verabreichung einer Dosis von 1 000 mg/kg bzw. einer höheren Dosis, die einer möglichen Exposition beim Menschen entspricht, keine toxischen Auswirkungen, so ist eine weitere Prüfung nicht erforderlich.

1.6.2.5. Beobachtungszeitraum

Alle Tiere sind täglich auf Symptome toxischer Wirkungen zu beobachten. Der Eintritt des Todes und der Zeitpunkt, zu dem Symptome auftreten und/oder wieder abklingen, sind festzuhalten.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Die Tiere sollten einzeln in Käfigen gehalten werden. Sie erhalten die Prüfsubstanz vorzugsweise an 7 Tagen pro Woche über einen Zeitraum von 28 Tagen. Die Tiere einer Satellitengruppe, die für eine Nachbeobachtung vorgesehen sind, sollten für weitere 14 Tage ohne Behandlung gehalten werden, um die Reversibilität bzw. Fortbestehen toxischer Wirkungen zu beobachten. Die Expositionszeit beträgt mindestens 6 Stunden pro Tag.

Die Prüfsubstanz ist einheitlich auf einen Bereich, der etwa 10 % der Körperoberfläche entspricht, aufzutragen. Bei hochtoxischen Substanzen kann die behandelte Oberfläche kleiner sein, es sollte jedoch ein möglichst grosser Bereich mit einer möglichst dünnen und einheitlichen Schicht exponiert werden.

Die Prüfsubstanz ist während der Expositionszeit mit einem porösen Mullverband und einem hautschonenden Pflaster in Kontakt mit der Haut zu halten. Die Versuchsfläche ist ausserdem auf eine geeignete Art abzudecken, um den Mullverband und die Prüfsubstanz zu fixieren und sicherzustellen, daß die Tiere die Prüfsubstanz nicht oral aufnehmen können. Es können auch Mittel zur Einschränkung der Bewegungsfreiheit angewendet werden, eine vollständige Immobilisierung ist jedoch nicht zu empfehlen. Als Alternative kann eine "Halsmanschette" verwendet werden.

Nach Ablauf der Expositionszeit entfernt man - soweit möglich - den Rest der Prüfsubstanz, und zwar unter Verwendung von Wasser oder eines anderen geeigneten Hautreinigungsverfahrens.

Alle Tiere sollen täglich beobachtet und Zeichen toxischer Wirkungen, darunter der Zeitpunkt des Auftretens sowie Grad und Dauer aufgezeichnet werden. Die Beobachtungen sollten sich insbesondere auf Veränderungen an Haut, Fell, Augen und Schleimhäuten, Atmung, Kreislauf, autonomem und zentralem Nervensystem sowie an der Somatomotorik und am Verhaltensmuster erstrecken. Die Futteraufnahme und das Gewicht der Tiere werden wöchentlich bestimmt. Eine regelmässige Beobachtung der Tiere ist erforderlich, um so weit wie möglich sicherzustellen, daß Tiere während des Versuchs nicht durch Kannibalismus, Autolyse der Gewebe oder Fehler beim Umsetzen verloren gehen. Nach Abschluß des Versuchszeitraumes werden alle überlebenden Tiere mit Ausnahme der Satellitengruppe seziert. Sterbende Tiere sowie Tiere, bei denen Anzeichen von starkem Leiden und Schmerzen festgestellt werden, sollten daraufhin sofort ausgesondert und unter Verwendung einer tierschutzgerechten Methode getötet und seziert werden.

Am Ende des Versuchs werden alle Tiere, einschließlich der Kontrolltiere, folgenden Untersuchungen unterzogen:

1) Die Hämatologie sollte mindestens die Bestimmung des Hämatokritwertes und Hämoglobinkonzentration, der Erythrozytenzahl, der Gesamt- und Differential-Leukozytenzahl sowie die Messung der Gerinnungsfähigkeit umfassen.

2) Klinisch-biochemische Analyse des Blutes: Zur Beurteilung der Leber- und Nierenfunktion sollte zumindest je einer der folgenden Parameter bestimmt werden: Alanin-Aminotransferase (früher bekannt als Serum-Glutamat-Pyruvat-Transaminase), Aspartat-Aminotransferase (früher bekannt als Serum-Glutamat-Oxalazetat-Transaminase), Harnstoff-Stickstoff, Albumin, Kreatinin, Gesamt-Bilirubin und Gesamt-Serum-Protein.

Bestimmungen weiterer blutchemischer Parameter, die ggf. für eine adäquate toxikologische Bewertung erforderlich sind, umfassen: Kalzium, Phosphor, Chlorid, Natrium, Kalium, Nüchternglukose, Lipide, Hormone, Säuren-Basen-Gleichgewicht, Methämoglobin, Cholinesteraseaktivität.

Zusätzliche klinisch-biochemische Analysen können ggf. notwendig sein, um die Untersuchung der beobachteten Effekte zu vertiefen.

1.6.4. Autopsie

An allen am Versuch beteiligten Tieren wird eine vollständige Autopsie vorgenommen. Zumindest die Leber, die Nieren, die Nebennieren und die Hoden werden sobald wie möglich nach der Sektion feucht gewogen, um ein Austrocknen zu verhindern. Organe und Gewebe, d. h. unbehandelte und behandelte Haut, Leber, Nieren, Milz, Hoden, Nebennieren, Herz und Zielorgane (Organe mit makroskopischen Veränderungen bzw. Grössenveränderungen) sind in einem geeigneten Medium für mögliche spätere histopathologische Untersuchungen aufzubewahren.

1.6.5. Histopathologische Untersuchungen

Bei allen Tieren der Gruppe mit der höchsten Dosierung sowie bei den Tieren der Kontrollgruppe ist eine histologische Untersuchung der konservierten Organe und Gewebe durchzuführen. Alle Organe und Gewebe, die in der Gruppe mit der höchsten Dosierung prüfsubstanzbedingte Schädigungen aufweisen, müssen auch bei allen anderen Gruppen bei geringerer Dosierung untersucht werden. Bei den Tieren der Satellitengruppe sind jene Organe und Gewebe mit besonderer Aufmerksamkeit zu untersuchen, bei denen in den anderen behandelten Gruppen Vergiftungssymptome auftraten.

2. DATEN

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus müssen für jede Dosisgruppe und Kontrollgruppe die Anzahl der Tiere zu Beginn des Versuchs und die Anzahl der Tiere mit den einzelnen Schädigungsformen zu entnehmen sein.

Alle ermittelten Ergebnisse sind durch ein geeignetes statistisches Verfahren zu bewerten. Dazu kann jede anerkannte statistische Methode herangezogen werden.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Angaben zu den Tieren (Tierart, Stamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.);

- Versuchsbedingungen (einschließlich Art des Verbandes: okklusiv oder nicht-okklusiv);

- Dosierungen (ggf. Vehikel) und Konzentrationen;

- N effect-level (NEL), falls möglich;

- Daten über toxische Reaktionen, nach Geschlecht und Konzentration;

- Zeitpunkt des Todes während des Versuchs bzw. Angabe, ob die Tiere den Versuch überlebten;

- toxische und andere Wirkungen;

- Zeitpunkt der Beobachtung der einzelnen Zeichen toxischer Wirkungen und deren weiterer Verlauf;

- Angaben über Fütterung und Körpergewicht;

- hämatologische Tests und deren Ergebnisse;

- klinisch-biochemische Tests und deren Ergebnisse;

- Sektionsbefunde;

- detaillierte Beschreibung der histopathologischen Befunde;

- statistische Auswertung der Ergebnisse, sofern möglich;

- Diskussion der Ergebnisse;

- Bewertung der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

B.10. MUTAGENITÄT (SÄUGER - ZYTOGENETISCHER "IN VITRO"-TEST)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt C).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Dieser zytogenetische in vitro-Test ist ein Kurzzeit-Mutagenitätstest zum Nachweis von strukturellen Chromosomenaberrationen an kultivierten Säugetierzellen. Sowohl Kulturen etablierter Zellinien als auch Primärkulturen können verwendet werden. Nach Exposition gegenüber Prüfsubstanzen mit und ohne geeignetem metabolisierdem System werden die Zellkulturen mit einem Spindelgift, z. B. Colchizin, behandelt, um eine Anreicherung von Metaphasen (sog. C-Metaphasen) zu erhalten. Die Zellen werden zu geeigneten Zeitpunkten aufgearbeitet, und Chromosomenpräparate werden hergestellt. Die Präparate werden gefärbt, und die Metaphasen werden im Hinblick auf Chromosomenveränderungen untersucht.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

1.6.1.1. Zellen

Es werden etablierte Zellinien bzw. Primärkulturen verwendet, z. B. Zellen von Chinesischen Hamstern oder menschlichen Lymphozyten. Die Prüfchemikalien werden vor der Behandlung der Zellen in Kulturmedien angesetzt bzw. in geeigneten Trägermedien gelöst.

1.6.1.2. Stoffwechsel-Aktivierungssystem

Die Zellen sind gegenüber der Prüfsubstanz mit und ohne Zusatz eines geeigneten metabolisierden Systems zu exponieren. Das am häufigsten verwendete System ist eine mit Cofaktoren angereicherte post-mitochondriale Fraktion, die aus mit Enzyminduktoren behandelten Lebern von Nagetieren gewonnen wird.

1.6.2. Prüfbedingungen

Zahl der Kulturen:

Für jeden experimentellen Punkt werden mindestens zwei Kulturen verwendet.

Durchführung von Negativ- und Positivkontrollen:

Das Lösungsmittel (falls weder das Kulturmedium noch Wasser das Lösungsmittel sind), das Leberenzym-Aktivierungsgemisch, das Lösungsmittel mit Leberenzym-Aktivierungsgemisch sowie unbehandelte Kontrollen werden als Negativkontrollen verwendet.

Ausserdem enthält jedes Experiment eine Positiv-Kontrolle. Wird ein Leberenzym-Aktivierungsgemisch zur Aktivierung der Testchemikalie verwendet, so ist als Positiv-Kontrolle eine Verbindung einzusetzen, die bekanntermassen eine Stoffwechselaktivierung erfordert.

Dosierung:

Mindestens 3 Konzentrationen der Prüfsubstanz sind einzusetzen, die sich mindestens über eine Zehnerpotenz erstrecken. Die höchste Konzentration sollte die Mitoseaktivität um etwa 50 % hemmen oder ein anderes Anzeichen für Zytotoxizität aufweisen. Wenn die Prüfsubstanz nicht toxisch ist, ist sie bis zur Löslichkeitsgrenze oder bis zu einer Hoechstkonzentration von 5 mg/ml zu prüfen.

Kulturbedingungen:

Geeignete Kulturmedien und Kulturbedingungen (z. B. Temperatur, verwendete Kulturgefässe, CO2-Konzentrationen sowie Feuchtigkeit) sind zu verwenden.

1.6.3. Versuchsdurchführung

1.6.3.1. Präparation der Kulturen

Etablierte Zellinien: Zellen werden aus Stamm-Kulturen gewonnen (z. B. durch Trypsinierung bzw. Abschütteln), in geeigneter Dichte in Kulturgefässe ausgesät und bei 37 C inkubiert.

Menschliche Lymphozyten: heparinisiertes Blut wird einem Kulturmedium zugesetzt, das Phytohämagglutinin, fetales Kälberserum und Antibiotika enthält. Die Inkubation erfolgt bei 37 C.

1.6.3.2. Behandlung der Kulturen mit der Prüfsubstanz

(i) Behandlung ohne Leberenzym-Aktivierungsgemisch

Soweit möglich sollten alle Behandlungen den Zeitraum eines gesamten Zellzyklus abdecken. Das Aufarbeitungsschema soll gewährleisten, daß erste Mitosen von Zellen analysiert werden, die zu verschiedenen Stadien behandelt wurden.

Umfasst die Behandlung nicht die gesamte Länge eines Zellzyklus, so sind die Fixationszeiten so zu wählen, daß Zellen gesammelt werden, die sich während der Behandlung in verschiedenen Phasen des Zellzyklus (z. B. G1, S und G2) befanden.

Die Prüfchemikalie wird Kulturen mit etablierten Zellinien in der exponentiellen Wachstumsphase beigegeben. Menschliche Lymphozyten werden im semisynchronen Zustand behandelt.

(ii) Behandlung unter Zusatz eines Leberenzym-Aktivierungsgemischs

Die Prüfsubstanz sollte so lange wie möglich zusammen mit dem Aktivierungssystem zur Behandlung vorliegen, ohne dabei eine toxische Wirkung auf die Zellen auszuüben. Sollte aus Gründen der

Toxizität diese Behandlung nicht die Dauer eines vollen Zellzykluses umfassen, sind die Fixationszeiten so zu wählen, daß Zellen gesammelt werden, die sich während der Behandlung in verschiedenen Phasen des Zellzyklus (z. B. G1, S und G2) befanden.

Aufarbeitung der Zellen:

Die Zellkulturen werden vor Aufarbeitung über einen geeigneten Zeitraum mit einem Spindelgift behandelt. Die Kulturen werden einzeln geerntet und für die Chromosomen-Präparation aufgearbeitet.

Es sind mindestens zwei Präparationszeiten erforderlich. Es wird empfohlen, daß der erste etwa nach einem Zellzyklus und der zweite später erfolgt. Dadurch wird sichergestellt, daß alle Phasen des Zellzyklus abgedeckt und Verzögerungen im Zellzyklus berücksichtigt werden.

1.6.3.3. Präparation der Chromosomen

Die Präparation der Chromosomen umfasst hypotone Behandlung der Zellen, Fixierung, Aufbringen auf Objektträger und Färbung.

Analyse:

Mindestens 100 gut gespreitete Metaphasen pro Kultur werden auf Chromosomenaberrationen analysiert. Objektträger werden vor der Analyse kodiert. Bei menschlichen Lymphozyten werden nur Metaphasen mit 46 Zentromeren analysiert.

In etablierten Zellinien werden nur Metaphasen ausgewertet, deren Zentromerzahl um höchstens 2 von der Modalzahl abweicht.

Darüber hinaus ist für jede Konzentration der Mitoseindex oder ein anderer Hinweis auf Zytotoxizität während des Tests zu ermitteln.

2. DATEN

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Aberrationen vom Chromatid-Typ (Gaps, Brüche, Interchanges), Aberrationen vom Chromosomen-Typ (z. B. Gaps, Brüche, Minutes, Ringe, dizentrische und polyzentrische Chromosomen) und die Zahl der aberranten Metaphasen (einschließlich und ausschließlich Gaps) werden getrennt für alle behandelten Kulturen und Kontrollkulturen aufgeführt.

Die Daten werden anhand geeigneter statistischer Methoden beurteilt.

Die Testergebnisse müssen mit gleichzeitigen Negativkontrollen verglichen werden.

Es sind mindestens zwei unabhängige Experimente durchzuführen. Wenn es jedoch aus wissenschaftlicher Sicht gerechtfertigt erscheint, kann auch ein einziges Experiment ausreichen. Es ist nicht notwendig, das zweite Experiment in identischer Weise durchzuführen wie das erste. Es kann sogar von Vorteil sein, bestimmte Prüfbedingungen zu ändern, um stichhaltigere Daten zu erhalten.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Verwendete Zellen;

- Versuchsbedingungen: Zusammensetzung des Mediums, CO2-Konzentration, Inkubationstemperatur, Inkubationszeit, Konzentrationen, Behandlungszeit, Dauer der Behandlung mit dem Spindelgift sowie dessen Konzentration, Art des verwendeten Leberenzym-Aktivierungsgemischs, Positiv- und Negativkontrollen;

- Anzahl der Zellkulturen;

- Anzahl der analysierten Metaphasen (getrennte Daten für die einzelnen Kulturen);

- Mitoseindex oder andere Hinweise auf Zytotoxizität;

- Art und Anzahl der Aberrationen je behandelter Kultur und je Kontrollkultur, Modalzahl der Chromosomen in den verwendeten etablierten Zellinien;

- Statistische Auswertung;

- Diskussion der Ergebnisse;

- Bewertung der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

B.11. SÄUGER KNOCHENMARK ZYTOGEN. "IN VIVO"-TEST, CHROMOSOMENANALYSE

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt C).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Dieser zytogenetische in vivo-Test ist ein Kurzzeit-Mutagenitätstest zum Nachweis von strukturellen Chromosomenaberrationen. Im allgemeinen werden Chromosomen-Aberrationen in den ersten Mitosen nach der Behandlung analysiert. Bei chemischen Mutagenen sind die meisten der induzierten Aberrationen vom Chromatid-Typ.

Bei dieser Prüfmethode werden Knochenmarkzellen von Säugetieren verwendet, denen die Prüfsubstanz auf geeignetem Wege verabreicht wird und die in bestimmten Zeitabständen getötet werden. Die Tiere werden ausserdem, bevor man sie tötet, mit einem Spindelgift, z. B. Colchizin, behandelt, um Metaphasen (sog. C-Metaphasen) anzureichern. Aus den Zellen werden luftgetrocknete Chromosomenpräparate hergestellt und gefärbt. Die Metaphasen werden mikroskopisch auf das Auftreten von Chromosomenaberrationen untersucht.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

Die Prüfsubstanzen werden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Falls hierin unlöslich, werden sie in geeigneten Trägermedien gelöst oder suspendiert.

Verwendung finden frisch angesetzte Lösungen der Prüfsubstanz. Wird ein Trägermedium verwendet, um die Dosierung zu erleichtern, so darf es weder mit der Prüfsubstanz reagieren noch toxisch wirken.

1.6.2. Prüfbedingungen

1.6.2.1. Versuchstiere

Eingesetzt werden Nagetiere, z. B. Ratten, Mäuse oder Chinesische Hamster. Gesunde junge erwachsene Tiere werden randomisiert und den Behandlungs- und Kontrollgruppen zugeteilt.

1.6.2.2. Anzahl und Geschlecht

Pro Versuchs- und Kontrollgruppe werden mindestens fünf weibliche und fünf männliche Tiere eingesetzt. Sieht der Versuchsplan mehrere Aufarbeitungszeiten nach der Behandlung vor, so sind demnach 10 Tiere pro Aufarbeitungszeit und Gruppe einzusetzen.

Für die Gruppe der Positivkontrollen ist eine Aufarbeitungszeit ausreichend.

1.6.2.3. Art der Verabreichung

Im allgemeinen sollten die Prüfsubstanzen nur einmal verabreicht werden. Auf der Grundlage toxikologischer Informationen sind wiederholte Behandlungen möglich. Sie sind jedoch nur dann angebracht, wenn die Prüfsubstanz keine zytotoxischen Auswirkungen auf Zellen des Kochenmarks hat. Übliche Arten der Verabreichung sind die orale Applikation und die intraperitoneale Injektion. Gegebenenfalls eignen sich auch andere Arten der Verabreichung.

1.6.2.4. Negativ- und Positivkontrolle

Als Positiv-Kontrollsubstanz wird eine Verbindung eingesetzt, von der bekannt ist, daß sie in vivo Chromosomen-Aberrationen verursacht. Eine Negativ-(Lösungsmittel)-Kontrollgruppe ist ebenfalls Bestandteil jedes Versuchs.

1.6.2.5. Dosierungen

In der Grundstufe wird eine Dosis der Prüfsubstanz verwendet. Dabei handelt es sich um die maximal verträgliche Dosis oder eine solche Dosis, die gewisse Anzeichen von Zytotoxizität verursacht (z. B. partielle Mitosehemmung).

Bei "nichttoxischen" Substanzen liegt bei einmaliger Gabe die zu prüfende höchste (Limit-)Dosis bei 2 000 mg/kg Körpergewicht.

Bei wiederholten Behandlungen liegt die Limitdosis bei 1 000 mg/kg Körpergewicht pro Tag.

Zusätzliche Dosierungen können gewählt werden, falls dies aus wissenschaftlichen Gründen angezeigt erscheint.

Dient der Test als Methode zur Verifizierung, sollten zumindest zwei weitere Dosierungen eingesetzt werden.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Der Test kann auf zwei verschiedene Weisen erfolgen:

(i) Die Tiere werden einmalig mit der maximal verträglichen Dosis der Prüfsubstanz behandelt. Zunächst erfolgt die Aufarbeitung 24 Stunden nach der Behandlung. Wenn die Ergebnisse in dieser Phase deutlich positiv sind, ist eine weitere Aufarbeitung nicht notwendig. Sind die Ergebnisse jedoch negativ oder nicht eindeutig - da die Kinetik des Zellzyklus durch die Prüfchemikalie beeinflusst werden kann - erfolgt zusätzlich eine Aufarbeitung zu einem früheren und einem späteren Zeitpunkt, und zwar innerhalb von 6 bis 48 Stunden nach der Behandlung.

Bei zusätzlichen Dosisgruppen der Prüfsubstanz sollte die Aufarbeitung zu den besonders sensitiven Zeitpunkten erfolgen. Falls diese nicht bekannt sind, werden die Tiere 24 Stunden nach der Behandlung getötet.

(ii) Lassen Informationen über die Pharmakokinetik und den Metabolismus wiederholte Behandlungen angezeigt erscheinen, sind wiederholte Applikationen möglich. Die Tötung der Tiere sollte dann 6 und 24 Stunden nach der letzten Behandlung erfolgen.

Knochenmarkpräparation:

Bevor man die Tiere tötet, wird ihnen intraperitoneal eine geeignete Dosis des Spindelgifts injiziert, um eine genügend grosse Zahl an Zellen zu erhalten, die sich in der C-Metaphase befinden. Durch Herausspülen mit einer isotonischen Lösung wird das Knochenmark aus beiden Oberschenkeln der unmittelbar zuvor getöteten Tiere gewonnen. Nach geeigneter hypotonischer Behandlung werden die Zellen fixiert und nach Lufttrocknung auf Objektträgern gefärbt.

Analyse:

Die Objektträger werden vor der mikroskopischen Analyse kodiert. Mindestens 50 gut gespreitete Metaphasen mit vollständiger Zentromerenzahl werden pro Tier auf strukturelle Chromosomenaberrationen untersucht. Zusätzlich können für jedes Tier die Mitoseindizes festgestellt werden.

2. DATEN

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Chromatiden- und Isochromatiden-Aberrationen (Gaps, Brüche, Interchanges) und die Mitoseindizes, sofern ermittelt, werden getrennt für alle behandelten Tiere und alle Kontrolltiere aufgeführt. Ausserdem sind für jede Versuchs- und Kontrollgruppe die Mittelwerte und die Standardabweichungen anzugeben. Die Daten werden anhand geeigneter statistischer Verfahren ausgewertet.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Art, Stamm und Alter der verwendeten Tiere;

- Zahl der Tiere (männlich/weiblich) je Versuchs- und Kontrollgruppe;

- Versuchsbedingungen: detaillierte Beschreibung der Behandlung bzw. Probeentnahme, Dosierungsniveaus, Dauer der Behandlung mit dem angewendeten Spindelgift sowie dessen Konzentration;

- Anzahl der pro Tier analysierten Metaphasen;

- Mitoseindex, wenn vorhanden;

- Art und Anzahl der Aberrationen, getrennt nach behandelten und Kontrolltieren;

- Anzeichen von Toxizität im Verlauf des Versuchs;

- statistische Auswertung;

- Diskussion der Ergebnisse;

- Auswertung der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

B.12. MUTAGENITÄT (MIKROKERNTEST)

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt C).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Der Mikrokerntest ist ein in-vivo-Kurzzeit-Test zum Nachweis einer Chromosomenschädigung oder einer Schädigung des Mitoseapparates durch Chemikalien. Grundlage dieses Tests ist ein vermehrtes Auftreten an Mikrokernen in polychromatischen Erythrozyten behandelter Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren.

Mikrokerne bilden sich aus Chromosomenbruchstücken oder ganzen Chromosomen in proliferierenden Zellen. Wenn sich Erythroblasten zu Erythrozyten entwickeln, wird der Hauptkern ausgestossen, während der Mikrokern im Zytoplasma verbleiben kann. Ausgewertet werden daher bei diesem Test frische polychromatische Erythrozyten aus dem Knochenmark von Säugetieren, denen die Prüfsubstanz auf geeignete Weise verabreicht wurde. Das Knochenmark wird extrahiert, Ausstriche werden angefertigt und gefärbt. Mikroskopisch wird das Vorhandensein von Mikrokernen in den polychromatischen Erythrozyten untersucht. Zusätzlich wird das Verhältnis der polychromatischen zu den normochromatischen Erythrozyten festgestellt.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

Die Prüfsubstanzen werden in isotonischer Lösung gelöst. Falls hierin unlöslich, werden sie in geeigneten Trägermedien gelöst oder suspendiert. Wird zur leichteren Verabreichung ein Trägermedium verwendet, so darf dieses weder mit der Prüfsubstanz reagieren noch toxisch wirken. Normalerweise werden frisch angesetzte Lösungen der Prüfsubstanz verwendet.

1.6.2. Prüfbedingungen

1.6.2.1. Versuchstiere

Es empfiehlt sich, Mäuse zu verwenden, jedoch können auch andere Säugetiere eingesetzt werden. Gesunde junge erwachsene Tiere werden randomisiert und den Behandlungs- und Kontrollgruppen zugeteilt.

1.6.2.2. Anzahl und Geschlecht

Mindestens fünf weibliche und fünf männliche Tiere werden pro Versuchs- und Kontrollgruppe eingesetzt. Sieht der Versuchsplan mehrere Aufarbeitungszeiten nach der Behandlung vor, so sind demnach 10 Tiere pro Aufarbeitungszeit und Gruppe einzusetzen. Für die Gruppe der Positivkontrollen ist eine Aufarbeitungszeit ausreichend.

1.6.2.3. Art der Verabreichung

Im allgemeinen sollten die Prüfsubstanzen nur einmal verabreicht werden. Auf der Grundlage toxikologischer Informationen sind wiederholte Behandlungen möglich. Sie sind jedoch nur angebracht, wenn die Prüfsubstanz keine zytotoxischen Auswirkungen auf Zellen des Kochenmarks hat. Übliche Arten der Verabreichung sind die orale Applikation oder die intraperitoneale Injektion. Gegebenenfalls eignen sich auch andere Arten der Verabreichung.

1.6.2.4. Verwendung von Negativ- und Positivkontrollen

In jedem Versuch werden sowohl Positiv- als auch Negativ-(Lösungsmittel)-Kontrollen verwendet.

1.6.2.5. Dosierungen

In der Grundstufe wird eine Dosis der Prüfsubstanz verwendet. Dabei handelt es sich um die maximal verträgliche Dosis oder eine solche Dosis, die gewisse Anzeichen von Zytotoxizität verursacht, z. B. durch eine Veränderung des Verhältnisses von polychromatischen zu normochromatischen Erythrozyten.

Bei "nichttoxischen Substanzen" liegt die nach Verabreichung einer Einzeldosis zu prüfende höchste (Limit-)Dosis bei 2 000 mg/kg Körpergewicht.

Bei wiederholten Behandlungen liegt die Limitdosis bei 1 000 mg/kg Körpergewicht pro Tag.

Zusätzliche Dosierungen können gewählt werden, falls dies aus wissenschaftlichen Gründen angezeigt erscheint.

Dient der Test als Methode zur Verifizierung, sollten zumindest zwei weitere Dosierungen eingesetzt werden.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Der Test kann auf zwei verschiedene Weisen erfolgen:

(i) Die Tiere werden einmalig mit der Prüfsubstanz behandelt. Die Aufarbeitung sollte zum Zeitpunkt der grössten Mikrokernhäufigkeit erfolgen. Da dieser je nach Prüfsubstanz unterschiedlich sein kann, erfolgt die Aufarbeitung mindestens zu zwei verschiedenen Zeiten. Der früheste Zeitpunkt liegt 12 Stunden, der späteste 48 Stunden nach der Behandlung.

Werden zusätzliche Dosierungen verwendet, sollte das Knochenmark zum sensitivsten Zeitpunkt entnommen werden oder, falls dieser nicht bekannt ist, 24 Stunden nach der Behandlung.

(ii) Lassen Informationen über die Pharmakokinetik und den Metabolismus wiederholte Behandlungen angezeigt erscheinen, sind wiederholte Applikationen möglich. Die Aufarbeitung sollte dann einmalig erfolgen, frühestens 12 Stunden nach der letzten Behandlung.

Knochenmarkpräparation:

Durch Herausspülen mit fetalem Kälberserum wird das Knochenmark aus beiden Oberschenkeln der unmittelbar zuvor getöteten Tiere gewonnen. Die Sedimentierung der Zellen erfolgt durch Zentrifugierung, der Überstand wird verworfen. Tropfen der homogenen Zellsuspension trägt man auf Objektträger auf, fertigt Ausstriche an und färbt sie nach Lufttrocknung.

Analyse:

Die Objektträger werden vor der mikroskopischen Analyse kodiert. Mindestens 1 000 polychromatische Erythrozyten pro Tier werden zur Bestimmung der Häufigkeit der Mikrokerne analysiert.

Das Verhältnis von normochromatischen zu polychromatischen Erythrozyten wird für jedes einzelne Tier durch Auszählen von insgesamt 1 000 Erythrozyten bestimmt.

2. DATEN

Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Die Zahl der ausgewerteten polychromatischen Erythrozyten, die Zahl der polychromatischen Erythrozyten mit Mikrokernen und die Prozentzahl der Zellen mit Mikrokernen sowie das Verhältnis von normochromatischen zu polychromatischen Erythrozyten werden getrennt für alle behandelten Tiere sowie Kontrolltiere aufgeführt. Ausserdem sind für jede Versuchs- und Kontrollgruppe die Mittelwerte und die Standardabweichungen anzugeben. Die Daten werden anhand geeigneter statistischer Methoden ausgewertet.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. PRÜFBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Art, Stamm und Alter der verwendeten Tiere;

- Zahl der Tiere (männlich/weiblich) je Versuchs- und Kontrollgruppe;

- Versuchsbedingungen: detaillierte Beschreibung der Behandlung und Probeentnahme, Dosierungen, Toxizitätsdaten, Negativ- und Positivkontrolle;

- Kriterien zur Klassifizierung der Mikrokerne;

- wenn möglich, Dosis-Wirkungs-Beziehung;

- Anzeichen von Toxizität im Verlauf des Versuchs;

- statistische Auswertung;

- Diskussion der Ergebnisse;

- Auswertung der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

B.13. ESCHERICHIA COLI - RÜCKMUTATIONSVERSUCH

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt C).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Das Escherichia coli-Tryptophan (trp)-Reversionssystem ist ein mikrobielles System, in dem eine durch Chemikalien induzierte trp . trp+-Reversion gemessen wird. Diese Mutation beruht auf Basenveränderungen im Genom des Bakteriums.

Die Bakterien werden gegenüber der Prüfsubstanz mit und ohne Zusatz eines metabolisierenden Systems exponiert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit auf einem Minimalmedium werden die Revertanten-Kolonien ausgezählt. Sie werden mit der Zahl der Spontan-Revertanten verglichen, die in einer unbehandelten und einer nur mit einem Lösungsmittel versehenen Kontrollkultur auftreten.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

Folgende Methoden können zur Durchführung des Versuchs verwendet werden:

(1) die Vorinkubationsmethode und

(2) der direkte Plattentest; hierbei werden Bakterien und Prüfsubstanz mit Top-Agar vermischt und auf die Oberfläche einer Selektiv-Agarplatte verteilt.

1.6.1. Vorbereitung

1.6.1.1. Bakterien

Bakterien werden bei 37 C bis zur späten exponentiellen bzw. zur frühen stationären Phase gezuechtet. Die Zelldichte sollte etwa 108-109 pro ml betragen.

1.6.1.2. Stoffwechselaktivierung

Die Bakterien sollten gegenüber der Testsubstanz exponiert werden, und zwar sowohl mit und ohne Zusatz eines geeigneten Stoffwechsel-Aktiverungssystems. Das am häufigsten verwendete System ist eine mit Cofaktoren angereicherte post-mitochondriale Fraktion, die aus mit Enzyminduktoren behandelten Lebern von Nagetieren gewonnen wird.

1.6.2. Versuchsbedingungen

1.6.2.1. Versuchsstämme

Drei Stämme - WP2, WP2 uvr A und WP2 uvr A pKM 101 - sollten verwendet werden. Anerkannte Methoden für die Kultivierung und Lagerung von Stammkulturen sind anzuwenden. Die Wachstumsbedingungen und die genetischen Eigenschaften der Stämme, ihre Empfindlichkeit gegenüber UV-Strahlen und Mitomycin C sowie die Resistenz des Stammes WP2 uvr A pKM 101 gegenüber Ampicillin sind zu überprüfen. Die Zahl der Spontan-Revertanten sollte für alle Stämme im Rahmen der erwarteten normalen Streubreiten liegen.

1.6.2.2. Medien

Ein geeignetes Selektivmedium für das Wachstum und die Selektion der Mutanten wird zusammen mit einem geeigneten Top-Agar verwendet.

1.6.2.3. Verwendung von Negativ- und Positivkontrollen

Sowohl unbehandelte als auch mit Lösungsmitteln versetzte Kontrollkulturen müssen gleichzeitig angelegt werden. Positivkontrollen müssen für die folgenden beiden Zwecke durchgeführt werden:

(i) Bestätigung der Sensibilität der Bakterienstämme.

Hierfür können Methylmethansulfonat, 4-Nitrochinolinoxid bzw. Ethylnitrosoharnstoff als Positivkontrollen für Versuche ohne metabolische Aktivierung verwendet werden.

(ii) Nachweis der Aktivität des entsprechenden stoffwechselaktivierenden Systems: 2-Aminoanthracen ist als Positivkontrolle für die Überprüfung der Aktivität eines metabolisierenden Systems für alle Stämme geeignet. Falls verfügbar, sollte eine Positiv-Kontrolle mit einer Substanz durchgeführt werden, die der gleichen chemischen Stoffklasse wie die Prüfsubstanz angehört.

1.6.2.4. Konzentration der Prüfsubstanz pro Platte

Es werden mindestens fünf verschiedene Konzentrationen der Prüfsubstanz eingesetzt, die durch halblogarithmische Abstände voneinander getrennt sind. Die Substanzen werden bis zur Grenze ihrer Löslichkeit bzw. Toxizität geprüft. Die Toxizität wird durch eine Reduzierung der Zahl der Spontan-Revertanten, durch vermindertes Hintergrundwachstum bzw. anhand des Überlebens der Bakterien in behandelten Kulturen nachgewiesen. Nichttoxische Substanzen sollten bis zur Konzentration von 5 mg/Platte geprüft werden, bevor sie als negativ zu betrachten sind.

1.6.2.5. Inkubationsbedingungen

Die Platten werden 48 bis 72 Stunden lang bei 37 C inkubiert.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Beim direkten Plattentest ohne enzymatische Aktivierung werden Prüfsubstanz und 0,1 ml einer frischen Bakterienkultur zu 2,0 ml Top-Agar gegeben. Bei Tests mit metabolischer Aktivierung werden 0,5 ml eines Leberenzym-Aktivierungsgemisches mit einer adäquaten Menge einer post-mitochondrialen Fraktion zu dem Top-Agar gegeben, nachdem die Prüfsubstanz und Bakterien hinzugefügt wurden. Der Inhalt eines jeden Röhrchens wird gemischt und auf der Oberfläche einer Selektiv-Agarplatte verteilt. Nach dem Verfestigen des Top-Agars werden die Platten 48 bis 72 Stunden lang bei 37 C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Revertanten-Kolonien pro Platte ausgezählt.

Bei der Vorinkubationsmethode wird ein Gemisch aus der Prüfsubstanz, 0,1 ml einer frischen Bakterienkultur und einer adäquaten Menge eines Leberenzym-Aktivierungsgemisches bzw. der gleichen Menge einer Pufferlösung hergestellt und vorinkubiert, bevor 2,0 ml des Top-Agars beigegeben werden. Der weitere Ablauf unterscheidet sich nicht von der Methode des direkten Plattentests.

Bei beiden Verfahren sind mindestens drei Platten pro Konzentration einzusetzen.

2. DATEN

Die Anzahl der Revertanten-Kolonien pro Platte wird sowohl für die Kontroll- als auch für die Prüfsubstanz-Serien angegeben. Die Einzel- und Mittelwerte der Revertanten-Kolonien pro Platte sowie die Standardabweichungen sollten sowohl für die geprüfte Substanz als auch für die Kontrollen angegeben werden.

Die Auswertung der Daten sollte unter Verwendung geeigneter statistischer Methoden erfolgen.

Es sind mindestens zwei unabhängige Versuche durchzuführen. Es ist nicht notwendig, das zweite Experiment in identischer Weise durchzuführen wie das erste. Es kann sogar von Vorteil sein, bestimmte Prüfbedingungen zu ändern, um stichhaltigere Daten zu erhalten.

3. ABSCHLUSSBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Bakterien, verwendeter Stamm;

- Versuchsbedingungen: Dosierungen, Toxizität, Zusammensetzung der Medien; Methodik (Vorinkubation - Inkubation); Stoffwechselaktivierungssystem; Bezugssubstanzen, Negativ-Kontrollen;

- Zahl der Kolonien pro Platte, Mittelwert der Revertanten-Kolonien pro Platte, Standardabweichung, Dosis-Wirkungs-Beziehung, wenn möglich;

- Diskussion der Ergebnisse;

- Bewertung der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

B.14. SALMONELLA TYPHIMURIUM - RÜCKMUTATIONSVERSUCH

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt A).

1.2. DEFINITION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt C).

1.3. BEZUGSSUBSTANZEN

Keine.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Das Salmonella typhimurium-Histidin (his)-Reversionssystem ist ein mikrobielles System, in dem eine durch Chemikalien induzierte his . his+-Reversion gemessen wird, die auf Basensubstitutionen bzw. Rasterschubmutationen im Genom des Bakteriums beruhen.

Die Bakterien werden gegenüber der Prüfsubstanz mit und ohne Zusatz eines metabolisierendem Systems exponiert und auf ein Minimalmedium plattiert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit werden die Revertanten-Kolonien ausgezählt. Sie werden mit der Zahl der Spontan-Revertanten verglichen, die in einer unbehandelten und/oder einer nur mit einem Lösungsmittel versehenen Kontrollkultur auftreten.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Keine.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Vorbereitung

1.6.1.1. Bakterien

Frisch hergestellte Bakterienkulturen werden bei 37 C bis zur späten exponentiellen bzw. frühen stationären Wachstumsphase gezuechtet. Die Zelldichte sollte etwa 108- 109 pro ml betragen.

1.6.1.2. Stoffwechselaktivierung

Die Bakterien sollten gegenüber der Testsubstanz exponiert werden, und zwar sowohl mit und ohne Zusatz eines geeigneten Stoffwechsel-Aktiverungssystems. Das am häufigsten verwendete System ist eine mit Cofaktoren angereicherte post-mitochondriale Fraktion, die aus der mit Enzyminduktoren behandelten Leber von Nagetieren gewonnen wird.

1.6.2. Versuchsbedingungen

1.6.2.1. Versuchsstämme

Mindestens vier Stämme - TA 1535, TA 1537 oder TA 97, TA 98 und TA 100 - sind zu verwenden. Andere Stämme wie TA 1538 und TA 102 können zusätzlich benutzt werden. Anerkannte Methoden für die Kultivierung und Lagerung von Stammkulturen müssen angewendet werden. Die Wachstumsbedingungen und die genetischen Eigenschaften der Stämme, ihre Empfindlichkeit gegenüber UV-Strahlen und Kristallviolett sowie ihre Resistenz gegenüber Ampicillin sind zu überprüfen. Die Zahl der Spontan-Revertanten sollte für alle Stämme im Rahmen der erwarteten normalen Streubreite liegen.

1.6.2.2. Medien

Ein geeignetes Selektiv-Medium ist in Kombination mit einem adäquaten Top-Agar zu verwenden.

1.6.2.3. Verwendung von Negativ- und Positiv-Kontrollen

Sowohl unbehandelte als auch mit Lösungsmittel exponierte Kontrollkulturen müssen gleichzeitig angelegt werden. Positiv-Kontrollen müssen für die folgenden beiden Zwecke durchgeführt werden:

(i) Bestätigung der Sensibilität der Bakterienstämme.

Hierfür können folgende Stoffe für Versuche ohne Stoffwechselaktivierung verwendet werden:

Stamm:revertiert mit:

TA 1535, TA 100Natriumazid

TA 1538, TA 98, TA 972-Nitrofluoren

TA 15379-Aminoacridin

TA 102Kumol Hydroperoxid

(ii) Nachweis der Aktivität des geeigneten metabolisierenden Systems.

2-Aminoanthracen ist als Positiv-Kontrolle für die Überprüfung der Aktivität eines metabolisierenden Systems für alle Stämme geeignet. Falls verfügbar, sollte eine Positiv-Kontrolle mit einer Substanz durchgeführt werden, die der gleichen chemischen Stoffklasse wie die Prüfsubstanz angehört.

1.6.2.4. Konzentration der Prüfsubstanz pro Platte

Es werden mindestens fünf verschiedene Konzentrationen der Prüfsubstanz eingesetzt, die durch halblogarithmische Abstände voneinander getrennt sind. Die Substanzen werden bis zur Grenze ihrer Löslichkeit bzw. Toxizität geprüft. Die Toxizität wird durch eine Reduzierung der Zahl der Spontanrevertanten, durch vermindertes Hintergrundwachstum bzw. anhand des Überlebens der Bakterien in behandelten Kulturen nachgewiesen. Nichttoxische Substanzen sollten bis zur Konzentration von 5 mg/Platte geprüft werden, bevor sie als negativ zu betrachten sind.

1.6.2.5. Inkubationsbedingungen

Die Platten werden 48 bis 72 Stunden lang bei 37 C inkubiert.

1.6.3. Versuchsdurchführung

Beim direkten Plattentest ohne enzymatische Aktivierung werden Prüfsubstanz und 0,1 ml einer frischen Bakterienkultur zu 2,0 ml Top-Agar gegeben. Bei Tests mit metabolischer Aktivierung werden 0,5 ml eines Leberenzym-Aktivierungsgemisches mit einer adäquaten Menge einer post-mitochondrialen Fraktion zu dem Top-Agar gegeben, nachdem die Prüfsubstanz und Bakterien hinzugefügt wurden. Der Inhalt eines jeden Röhrchens wird gemischt und auf der Oberfläche einer Selektiv-Agarplatte verteilt. Nach dem Verfestigen des Top-Agars werden die Platten 48 bis 72 Stunden lang bei 37 C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Revertanten-Kolonien pro Platte ausgezählt. Bei der Vorinkubationsmethode wird ein Gemisch aus der Prüfsubstanz, 0,1 ml einer frischen Bakterienkultur und einer adäquaten Menge eines Leberenzym-Aktivierungsgemisches bzw. der gleichen Menge einer Pufferlösung hergestellt und vorinkubiert, bevor 2,0 ml des Top-Agars beigegeben werden. Der weitere Ablauf unterscheidet sich nicht von der Methode des direkten Plattentests.

Bei beiden Verfahren sind mindestens drei Platten pro Konzentration einzusetzen.

2. DATEN

Die Zahlen der Revertanten-Kolonien pro Platte werden sowohl für die Kontroll- als auch für die Prüfsubstanz-Serien angegeben.

Die Einzel- und Mittelwerte der Revertanten-Kolonien pro Platte sowie die Standardabweichungen sollten sowohl für die geprüfte Substanz als auch für die Kontrollen angegeben werden.

Die Auswertung der Daten sollte unter Verwendung geeigneter statistischer Methoden erfolgen.

Es sind mindestens zwei unabhängige Versuche durchzuführen. Es ist nicht notwendig, das zweite Experiment in identischer Weise durchzuführen wie das erste. Es kann sogar von Vorteil sein, bestimmte Prüfbedingungen zu ändern, um stichhaltigere Daten zu erhalten.

3. ABSCHLUSSBERICHT

3.1. Prüfbericht

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Bakterien, verwendeter Stamm;

- Versuchsbedingungen: Dosierungen, Toxizität, Zusammensetzung der Medien; Methodik (Vorinkubation - Inkubation), Stoffwechselaktivierungssystem; Bezugssubstanzen, Negativ-Kontrollen;

- Zahl der Kolonien pro Platte, Mittelwert der Revertanten-Kolonien pro Platte, Standardabweichung, Dosis-Wirkungs-Beziehung, wenn möglich;

- Diskussion der Ergebnisse;

- Bewertung der Ergebnisse.

3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt D).

4. LITERATUR

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B (Punkt E).

TEIL C: METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER ÖKOTOXIZITÄT

C.1. AKUTE TOXIZITÄT FÜR FISCHE

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Mit diesem Test soll die akute letale Toxizität einer Substanz für Fische in Süßwasser bestimmt werden. Soweit wie möglich sollten Angaben über die Wasserlöslichkeit, den Dampfdruck, die chemische Stabilität, die Dissoziationskonstanten und die biologische Abbaubarkeit der Substanz vorhanden sein, um die Auswahl der am besten geeigneten Prüfmethode (statisch, semistatisch oder im Durchfluß) zur Sicherstellung ausreichend konstanter Konzentrationen der Prüfsubstanz während des gesamten Prüfzeitraums zu erleichtern.

Weitere Angaben (z. B. Strukturformel, Reinheitsgrad, Art und Prozentanteil signifikanter Verunreinigungen, Vorhandensein und Menge von Zusätzen, sowie der n-Oktanol/Wasser-Verteilungsköffizient) sind sowohl bei der Planung der Prüfung als auch bei der Interpretation der Prüfergebnisse zu berücksichtigen.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Unter akuter Toxizität wird die deutlich erkennbare schädigende Wirkung verstanden, die in einem Organismus innerhalb kurzer Zeit (Tage) durch Einwirkung (Exposition) eines Stoffes hervorgerufen wird. In der vorliegenden Prüfung wird die akute Toxizität als die mittlere letale Konzentration (LC50) ausgedrückt; das ist die Konzentration im Wasser, die 50 % einer Prüfgruppe von Fischen innerhalb einer anzugebenden ununterbrochenen Einwirkungsdauer tötet.

Alle Konzentrationen der Prüfsubstanz sind in Gewicht/Volumen (mg/l) anzugeben. Sie können auch als Gewichtsanteile (mg/kg) angegeben werden.

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Eine Referenzsubstanz kann geprüft werden, um nachzuweisen, daß sich die Reaktion des Prüfsystems unter den Bedingungen der Prüfeinrichtung nicht wesentlich geändert hat.

Referenzsubstanzen sind für diesen Test noch nicht festgelegt.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Es kann ein Limit-Test mit 100 mg.l 1 durchgeführt werden, um nachzuweisen, daß die LC50 über dieser Konzentration liegt.

Die Fische werden der dem Wasser zugesetzten Prüfsubstanz für einen Zeitraum von 96 Stunden verschiedenen Konzentration ausgesetzt. Die Mortalitäten werden mindestens alle 24 Stunden erfasst; soweit möglich, werden bei jeder Beobachtung auch die Konzentrationen berechnet, die 50 % der Fische töten (LC50).

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Die Qualitätskriterien gelten für den Limit-Test als auch für das vollständige Prüfverfahren.

Die Mortalität darf bei den Kontroll-Prüfsystemen am Ende der Prüfung 10 % (bzw. einen Fisch, wenn weniger als 10 verwendet werden) nicht überschreiten.

Die Sauerstoffkonzentration muß über die gesamte Prüfdauer mehr als 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts betragen.

Die Konzentrationen der Prüfsubstanz sollen über den gesamten Prüfzeitraum bei bis zu 80 % der Anfangskonzentrationen gehalten werden.

Bei Substanzen, die im Prüfmedium leicht löslich sind und stabile Lösungen ergeben, d. h. Lösungen, die sich nicht in signifikantem Masse verfluechtigen oder nicht in einem solchen Masse abgebaut, hydrolisiert oder adsorbiert werden, kann die Anfangskonzentration als der nominalen Konzentration gleichwertig angesehen werden. Es ist nachzuweisen, daß die Konzentrationen über den gesamten Prüfzeitraum aufrechterhalten und die Qualitätskriterien erfuellt worden sind.

Bei Substanzen, die

(i) im Prüfmedium schwer löslich sind oder

(ii) stabile Emulsionen oder Dispersionen bilden können oder

(iii) in wäßrigen Lösungen nicht stabil sind, soll die Anfangskonzentration diejenige Konzentration sein, die bei Prüfbeginn in der Lösung (oder, wenn dies aus technischen Gründen nicht möglich ist, in der Wassersäule) gemessen worden ist. Die Konzentration soll nach einer Zeit der Äquilibrierung, jedoch vor Einbringen der Prüforganismen bestimmt werden.

In all diesen Fällen müssen weitere Messungen im Verlauf der Prüfung durchgeführt werden, um zu bestätigen, daß die Expositionskonzentrationen tatsächlich erreicht und die Qualitätskriterien erfuellt worden sind.

Der pH-Wert darf nicht um mehr als eine Einheit schwanken.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

Für die Durchführung der Prüfung aufgrund der vorliegenden Methode sind drei Verfahren möglich:

Statisches Verfahren:

Toxizitätsprüfung wobei das Prüfmedium während der Prüfdauer nicht erneuert wird.

Semistatisches Verfahren:

Das Prüfmedium wird regelmässig nach einem längeren Zeitraum (z. B. 24 Stunden) vollständig ausgewechselt.

Durchflußverfahren:

Das Prüfmedium wird ständig erneuert, wobei die Prüfsubstanz mit dem Wasser für die Erneuerung des Prüfmediums eingebracht wird.

1.6.1. Reagenzien

1.6.1.1. Lösungen der Prüfsubstanzen

Die Stammansätze in den erforderlichen Konzentrationen werden durch Lösung der Prüfsubstanz in deionisiertem Wasser oder Wasser entsprechend 1.6.1.2. hergestellt.

Die gewählten Prüfkonzentrationen werden durch Verdünnung des Stammansatzes zubereitet. Bei hohen Konzentrationen kann die Prüfsubstanz unmittelbar im Verdünnungswasser gelöst werden.

Die Substanzen sollten im allgemeinen nur bis zur Löslichkeitsgrenze geprüft werden. Bei einigen Substanzen (z. B. bei solchen mit geringer Wasserlöslichkeit oder hohem Pow oder solchen, die im Wasser eher eine stabile Dispersion als eine echte Lösung bilden), kann es angezeigt sein, eine Prüfkonzentration zu verwenden, die oberhalb der Löslichkeitsgrenze der Substanz liegt, um sicherzustellen, daß die höchste lösliche/stabile Konzentration erreicht worden ist. Wichtig ist jedoch, daß diese Konzentration das Prüfsystem nicht auf sonstige Weise stört (z. B. durch Bildung eines Substanzfilms auf der Wasseroberfläche, durch den die Anreicherung des Wassers mit Sauerstoff verhindert wird).

Durch Ultraschalldispersion, Verwendung organischer Lösungsmittel und emulgierender oder dispergierender Mittel können Stammansätze von Prüfsubstanzen mit geringer Wasserlöslichkeit hergestellt oder deren Dispersion im Prüfmedium gefördert werden. Werden derartige Hilfsstoffe verwendet, müssen alle Prüfkonzentrationen die gleiche Menge des Hilfsstoffes enthalten und müssen zusätzliche Kontroll-Fische derselben Konzentration an Hilfsstoffen ausgesetzt werden, wie sie in der Prüfreihe verwendet wurde. Die Konzentration derartiger Hilfsstoffe sollte niedrig gehalten werden, in keinem Fall jedoch 100 mg.l 1 im Prüfmedium überschreiten.

Die Prüfung ist ohne eine Einstellung des pH-Wertes durchzuführen. Gibt es Anzeichen für eine deutliche Änderung des pH-Wertes, wird empfohlen, die Prüfung mit einer pH-Wert-Einstellung zu wiederholen und die Ergebnisse entsprechend zu protokollieren. In diesem Fall ist der pH-Wert des Stammansatzes auf den pH-Wert des Verdünnungswassers einzustellen, falls nicht bestimmte Gründe dagegen sprechen. Hierzu sind möglichst HCl und NaOH zu verwenden. Die pH-Wert-Einstellung muß so erfolgen, daß sich die Konzentration der Prüfsubstanz im Stammansatz nicht wesentlich ändert. Sollte sich durch die Einstellung eine chemische Reaktion oder eine physikalische Ausfällung der Prüfsubstanz ergeben, so muß diese Beobachtung im Prüfbericht protokolliert werden.

1.6.1.2. Hälterungs- und Verdünnungswasser

Verwendet werden kann Leitungswasser (Trinkwasser) (nicht verunreinigt durch potentiell schädliche Konzentrationen an Chlor, Schwermetallen oder anderen Substanzen), einwandfreies natürliches Wasser oder zubereitetes Wasser (siehe Anlage 1). Am besten geeignet sind Wasserqualitäten mit einer Gesamthärte zwischen 10 und 250 mg.l 1 (bezogen auf CaCO3) und einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,5.

1.6.2. Geräte

Alle Geräte müssen aus chemisch inertem Material bestehen:

- Einrichtungen zur automatischen Verdünnung (für das Durchfluß-Verfahren);

- Sauerstoffmeßgerät;

- Gerät zur Bestimmung der Wasserhärte;

- geeignetes Gerät zur Temperaturmessung;

- pH-Meßgerät.

1.6.3. Prüforganismen

Die Fische müssen in guter gesundheitlicher Verfassung sein und dürfen keine offensichtlichen Mißbildungen aufweisen.

Es wird empfohlen, die verwendeten Arten nach so wichtigen praktischen Kriterien wie ihrer Verfügbarkeit im ganzen Jahr, ihrer problemlosen Hälterung, ihrer Eignung für Prüfzwecke, ihrer relativen Empfindlichkeit gegenüber Chemikalien sowie anderen ökonomisch, biologisch oder ökologisch bedeutsamen Faktoren auszuwählen. Ausserdem sollten bei der Auswahl der Fischarten die Notwendigkeit der Vergleichbarkeit der erhaltenen Daten und die bestehende internationale Harmonisierung (vgl. (1)) berücksichtigt werden.

Eine Liste der für die Prüfung empfohlenen Fischarten ist in Anlage 2 enthalten; bevorzugt verwendet werden Zebrabärblinge und Regenbogenforelle.

1.6.3.1. Hälterung

Die Fische sollten möglichst aus einer einzigen Charge bei etwa gleicher Länge und gleichem Alter stammen. Sie müssen mindestens 12 Tage unter folgenden Bedingungen gehältert werden:

Besatz: entsprechend dem Verfahren (Umwälzanlage oder Durchfluß) und der Fischart;

Wasser: siehe 1.6.1.2.;

Beleuchtung: 12 bis 16 Stunden Beleuchtungsdauer täglich;

Konzentration an gelöstem Sauerstoff: mindestens 80 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts;

Fütterung: Dreimal wöchentlich oder täglich, Aussetzung der Fütterung 24 Stunden vor Beginn der Fütterung.

1.6.3.2. Mortalität

Nach einer Eingewöhnungszeit von 48 Stunden wird die Mortalität unter Anwendung folgender Kriterien erfasst:

- bei mehr als 10 % der Population in sieben Tagen:

die Charge ist nicht verwendbar für den Test;

- zwischen 5 und 10 % der Population:

die Hälterungszeit ist weitere sieben Tage fortzusetzen. Treten keine weiteren Sterbefälle auf, ist die Charge für die Prüfung verwendbar, ansonsten nicht;

- bei 5 % und weniger der Population

die Charge ist für die Prüfung verwendbar.

1.6.4. Anpassung

Alle Fische sind für eine Mindestdauer von sieben Tagen vor ihrem Einsatz in der Prüfung in Wasser derselben Qualität und bei der gleichen Temperatur einzusetzen, wie es in der Prüfung verwendet wird.

1.6.5. Durchführung der Prüfung

Ein Vorversuch kann der eigentlichen Prüfung vorangehen. Dieser Vorversuch liefert Informationen über den in der eigentlichen Prüfung zu verwendenden Konzentrationsbereich.

Zusätzlich zu den Konzentrationen der Prüfsubstanz sind eine Kontrolle ohne die Prüfsubstanz und ggf. eine Kontrolle mit dem Hilfsstoff einzusetzen.

In Abhängigkeit von den physikalischen und chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz ist zur Erfuellung der Qualitätskriterien eine Prüfung in einem statischen, semistatischen oder Durchfluß-Verfahren auszuwählen.

Die Fische werden der Prüfsubstanz wie im folgenden beschrieben ausgesetzt:

- Dauer: 96 Stunden;

- Anzahl der Tiere: mindestens 7 je Konzentration;

- Behälter: geeignetes Fassungsvermögen im Verhältnis zum empfohlenen Besatz;

- Besatz: Als Hoechstbesatz werden im statischen und semistatischen Verfahren 1,0 g.l 1 empfohlen; im Durchfluß-Verfahren ist ein höherer Besatz möglich;

- Prüfkonzentration: mindestens fünf Konzentrationen, die sich durch einen konstanten Faktor unterscheiden, der 2,2 nicht überschreiten darf, und die den Bereich von 0 % bis 100 % Mortalität soweit wie möglich umfassen;

- Wasser: siehe 1.6.1.2.;

- Beleuchtung: 12 bis 16 Stunden Beleuchtungsdauer täglich;

- Temperatur: entsprechend der Fischart (Anlage 2), jedoch innerhalb 1 C bei jeder einzelnen Prüfung;

- Konzentration an gelöstem Sauerstoff: nicht unter 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswertes bei der gewählten Temperatur;

- Fütterung: keine.

Die Fische werden nach den ersten 2-4 Stunden und mindestens alle 24 Stunden beobachtet. Ein Fisch gilt als tot, wenn bei Berührung des Schwanzansatzes keine Reaktion erfolgt und wenn keine Atembewegungen erkennbar sind. Tote Fische sind, sobald sie bemerkt werden, zu entfernen und entsprechend zu protokollieren.

Für den Prüfbericht sind ausserdem weitere sichtbare Veränderungen zu erfassen (z. B. Gleichgewichtsverlust, Änderungen des Schwimmverhaltens, der Atmung, der Pigmentierung, usw.)

Messungen des pH-Wertes, des Gehalts an gelöstem Sauerstoff und der Temperatur müssen täglich erfolgen.

Limit-Test

Unter Verwendung der bei diesem Prüfverfahren beschriebenen Methoden kann ein Limit-Test mit 100 mg.l 1 durchgeführt werden, um nachzuweisen, daß die LC50 über dieser Konzentration liegt.

Wenn die Substanz so beschaffen ist, daß eine Konzentration von 100 mg.l 1 im Prüfwasser nicht erreicht werden kann, ist der Limit-Test mit einer Konzentration durchzuführen, die der Löslichkeit der Substanz (oder der höchsten Konzentration, die eine stabile Dispersion bildet) im verwendeten Medium entspricht (vgl. auch Punkt 1.6.1.1.).

Im Limit-Test sollten 7 bis 10 Fische untersucht und die gleiche Anzahl als Kontrollen verwendet werden. (Nach dem Binomischen Lehrsatz liegt bei Verwendung von 10 Fischen mit Null-Mortalität die Wahrscheinlichkeit bei 99,9 %, daß die LC50 höher ist als die im Limit-Test verwendete Konzentration. Bei 7, 8 oder 9 Fischen ergibt eine Null-Mortalität eine Wahrscheinlichkeit von mindestens 99 %, daß die LC50 höher ist als die verwendete Konzentration).

Bei Vorliegen von Sterbefällen ist das vollständige Verfahren anzuwenden. Wenn subletale Wirkungen beobachtet werden, sind diese zu protokollieren.

2. DATEN UND AUSWERTUNG

Die Mortalität wird für jeden Zeitraum, in dem Beobachtungen protokolliert wurden (24, 48, 72 und 96 Stunden), für jede empfohlene Expositionsdauer auf Wahrscheinlichkeits- (Probit-)papier (mit logarithmischer Einteilung) gegen die Konzentration aufgetragen.

Soweit möglich, sollten die LC50 und der jeweilige Vertrauensbereich (p = 0,05) für jeden Beobachtungszeitraum nach Standardverfahren ermittelt werden. Diese Werte sind auf eine oder höchstens zwei signifikante Stelle(n) zu runden (Beispiele für das Runden auf zwei Stellen: 170 für 173,5; 0,13 für 0,127; 1,2 für 1,21).

Sollte der Verlauf der Konzentrations-Wirkungs-Kurve für eine Berechnung der LC50 zu steil sein, so reicht eine graphische Abschätzung dieses Wertes.

Ergeben zwei unmittelbar aufeinanderfolgende Konzentrationen, die sich durch den Faktor 2,2 unterscheiden, nur 0 % und 100 % Mortalität, so werden diese beiden Werte zur Angabe des Bereichs, in den die LC50 fällt, herangezogen.

Wird beobachtet, daß die Stabilität oder Homogenität der Prüfsubstanz nicht aufrechterhalten werden kann, so ist dies im Prüfbericht mitzuteilen und bei der Interpretation der Ergebnisse entsprechend zu berücksichtigen.

3. ABSCHLUSSBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Angaben über die verwendeten Fische (wissenschaftlicher Name, Stamm, Zuechter oder Bezugsquelle, Vorbehandlungen, Grösse und Anzahl der einzelnen Prüfkonzentrationen);

- Herkunft des Verdünnungswassers und wichtige chemische Eigenschaften (pH-Wert, Härte, Temperatur);

- Bei Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit: Angabe der Methode zur Herstellung des Stammansatzes und der Prüflösungen;

- Konzentration aller Hilfsstoffe;

- Liste der verwendeten Konzentrationen sowie alle vorhandenen Informationen über die Stabilität der Prüfsubstanz in der Prüflösung bei den verwendeten Konzentrationen;

- bei Durchführung chemischer Analysen: Angabe der verwendeten Methoden und der Ergebnisse;

- ggf. Ergebnisse des Limit-Tests;

- Gründe für die Auswahl und Einzelheiten der Durchführung der Prüfung (z. B. statisch, semistatisch, Dosierungsrate, Durchflußrate, ob belüftet, Fischbesatz usw.);

- Beschreibung der Prüfgeräte;

- Beleuchtungsverhältnisse;

- Konzentrationen des gelösten Sauerstoffs, pH-Werte, Temperaturen in den Prüflösungen alle 24 Stunden;

- Nachweis, daß die Qualitätskriterien erfuellt sind;

- Tabelle der kumulativen Mortalität bei jeder Konzentration und bei der Kontrolle (ggf. auch bei der Kontrolle mit dem Hilfsstoff) zu den empfohlenen Beobachtungszeitpunkten;

- graphische Darstellung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve am Ende der Prüfung;

- wenn möglich, die LC50-Werte für jeden empfohlenen Beobachtungszeitpunkt (möglichst mit 95 % Vertrauensbereich);

- verwendete statistische Verfahren zur Bestimmung der LC50-Werte;

- bei Verwendung einer Referenzsubstanz Angabe der Ergebnisse;

- höchste eingesetzte Prüfkonzentrationen ohne Mortalität im Prüfzeitraum;

- niedrigste eingesetzte Prüfkonzentration mit 100 % Mortalität im Prüfzeitraum.

4. LITERATUR

(1) ÖCD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C (81) 30 final and updates.

(2) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods - NFT 90-303 June 1985.

(3) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow Through methods - NFT 90-305 June 1985.

(4) ISO 7364/1, /2 and /3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan - Teleostei, Cyprinidä). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974.

(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).

(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

(8) NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Pöcilia reticulata, 1980.

(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Commitee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.

(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.

(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.

(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.

(13) Commission of the European Communities,Inter-Laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC study D.8368, 22 March 1979.

(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(15) Lichtfield, J, T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Phare, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.

(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(17) Spragü, J. B. Measurement of pullutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(18) Spragü, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32.

(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelinck). American Society for Testing and Materials. ASTM STP 634, 1977, 65-84.

(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

Anlage 1

Zubereitetes Wasser Beispiel für ein geeignetes Verdünnungswasser Alle Chemikalien müssen analysenrein sein.

Das Wasser muß einwandfreies destilliertes oder deionisiertes Wasser mit einer Leitfähigkeit von weniger als 5 Scm 1 sein.

Die für die Destillation von Wasser verwendete Apparatur darf keine Kupferteile enthalten.

Stammlösungen

CaCl2.2H20 (Calciumchlorid Dihydrat) 11,76 g in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffuellen

MgSO4.7H2O (Magnesiumsulfat Heptahydrat) 4,93 g in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffuellen

NaHCO3 (Natriumhydrogencarbonat) 2,59 g in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffuellen

KCl (Kaliumchlorid) 0,23 g in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffuellen

Zubereitetes Verdünnungswasser

Je 25 ml der vier Stammlösungen mischen und mit Wasser auf 1 l auffuellen.

Solange belüften, bis die Konzentration an gelöstem Sauerstoff dem Luftsauerstoff-Sättigungswert entspricht.

Der pH-Wert muß 7,8 0,2 betragen.

Falls erforderlich, ist der pH-Wert mit NaOH (Natronlauge) oder HCl (Salzsäure) einzustellen.

Dieses Verdünnungswasser lässt man 12 Stunden stehen; eine weitere Belüftung ist nicht erforderlich.

Die Summe der Ca- und Mg-Ionen in dieser Lösung beträgt 2,5 mmol.l 1. Das Verhältnis der Ca- zu den Mg-Ionen beträgt 4:1 und das der Na- zu den K-Ionen 10:1. Die Gesamtalkalinität dieser Lösung liegt bei 0,8 mmol.l 1.

Eine abweichende Zubereitung des Verdünnungswassers darf die Zusammensetzung oder die Eigenschaften des Wassers nicht verändern.

Anlage 2

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Beschaffung

Die oben aufgeführten Fischarten lassen sich leicht zuechten und/oder sind das ganze Jahr über weitgehend verfügbar. Sie lassen sich in Fischzuchtbetrieben oder in Prüfeinrichtungen unter Bedingungen zuechten und aufziehen, die eine Kontrolle über Krankheiten und Parasiten erlauben, so daß sie für eine Prüfung gesund und von bekannter Herkunft sind. Diese Fischarten sind in vielen Teilen der Welt erhältlich.

Anlage 3

Beispiel für eine Konzentrations-Mortalitätskurve

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Beispiel für die Bestimmung der LC50 auf Wahrscheinlichkeitspapier

C.2. AKUTE TOXIZITÄT FÜR DAPHNIEN

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Mit diesem Test soll die mittlere effektive (Wirk-)Konzentration (EC50) einer Substanz zur Erzeugung von Schwimmunfähigkeit bei Daphnien in Süßwasser bestimmt werden. Soweit wie möglich sollten Angaben über die Wasserlöslichkeit, den Dampfdruck, die chemische Stabilität, die Dissoziationskonstanten und die biologische Abbaubarkeit der Prüfsubstanz vor dem Beginn der Prüfung vorhanden sein.

Weitere Angaben (z. B. Strukturformel, Reinheitsgrad, Art und Prozentanteil signifikanter Verunreinigungen, Vorhandensein und Menge von Zusätzen sowie der n-Oktanol/Wasser-Verteilungsköffizient) sind sowohl bei der Planung der Prüfung als auch bei der Interpretation der Prüfergebnisse zu berücksichtigen.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Die Forderung der Richtlinie nach Ermittlung der LC50 bei Daphnien gilt durch Bestimmung der EC50, wie sie in dieser Prüfmethode beschrieben wird, als erfuellt.

Im Sinne dieser Prüfmethode wird die akute Toxizität als die mittlere effektive (Wirk-)Konzentration (EC50) zur Erzeugung der Schwimmunfähigkeit verstanden. Dies ist die Konzentration, bezogen auf die Ausgangskonzentration, die 50 % der Daphnien einer Prüfgruppe innerhalb eines genau anzugebenden kontinuierlichen Einwirkungszeitraums (Expositionszeitraums) schwimmunfähig macht.

Schwimmunfähigkeit:

Es gelten diejenigen Daphnien als schwimmunfähig, die nach leichter Bewegung des Prüfbehälters innerhalb von 15 Sekunden keine Schwimmbewegungen zeigen.

Alle Konzentrationen der Prüfsubstanz sind in Gewicht/Volumen (mg.l 1) anzugeben. Sie können auch als Gewichtsanteile (mg.kg 1) angegeben werden.

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Eine Referenzsubstanz kann getestet werden, um nachzuweisen, daß sich die Reaktion der geprüften Art unter den Bedingungen der Prüfeinrichtung nicht wesentlich geändert hat.

Die Ergebnisse eines EWG-Ring-Tests unter Verwendung von vier verschiedenen Substanzen sind in Anlage 2 zusammengefasst.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Es kann ein Limit-Test mit 100 mg.l 1 durchgeführt werden, um nachzuweisen, daß die EC50 über dieser Konzentration liegt.

Die Daphnien werden der dem Wasser in verschiedenen Konzentrationen zugesetzten Prüfsubstanz für 48 Stunden ausgesetzt. Wird ein kürzerer Prüfzeitraum verwendet, ist dies im Prüfbericht zu begründen.

Unter sonst gleichen Prüfbedingungen und bei einem angemessenen Bereich von Prüfkonzentrationen wirken sich verschiedene Konzentrationen einer Prüfsubstanz unterschiedlich auf die Schwimmfähigkeit der Daphnien aus. Bei verschiedenen Konzentrationen ergeben sich dann nach Ablauf der Prüfzeit jeweils bestimmte prozentuale Anteile schwimmunfähiger Daphnien. Diejenigen Konzentrationen, die 0 % bzw. 100 % Schwimmunfähigkeit verursachen, werden direkt aus den Prüfbeobachtungen erhalten, während der 48-Stunden-EC50-Wert, soweit möglich, durch Berechnung ermittelt wird.

Bei dieser Methode wird ein statisches Verfahren angewendet. Die Prüflösungen werden daher während des Expositionszeitraums nicht erneuert.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Die Qualitätskriterien gelten sowohl für den Limit-Test als auch für das vollständige Prüfverfahren.

Bei den Kontrollen dürfen bei Versuchsende höchstens 10 % der Daphnien schwimmunfähig sein.

Die Daphnien der Kontrollgruppen dürfen nicht an der Wasseroberfläche hängenbleiben.

Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in den Prüfgefässen sollte während des gesamten Prüfzeitraums über 3 mg.l 1 betragen. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs darf jedoch auf keinen Fall unter 2 mg.l 1 absinken.

Die Konzentration der Prüfsubstanz soll über den gesamten Prüfzeitraum bei bis zu 80 % der Anfangskonzentration gehalten werden.

Bei Substanzen, die im Prüfmedium leicht löslich sind und stabile Lösungen ergeben, d. h. Lösungen, die sich nicht in signifikantem Masse verfluechtigen oder nicht in einem solchen Masse abgebaut, hydrolisiert oder adsorbiert werden, kann die Anfangskonzentration als der nominalen Konzentration gleichwertig angesehen werden. Es ist nachzuweisen, daß die Konzentrationen über den gesamten Prüfzeitraum aufrechterhalten und die Qualitätskriterien erfuellt worden sind.

Bei Substanzen, die

(i) im Prüfmedium schwer löslich sind oder

(ii) stabile Emulsionen oder Dispersionen bilden können oder

(iii) in wäßrigen Lösungen nicht stabil sind,

soll die Anfangskonzentration diejenige Konzentration sein, die bei Prüfbeginn in der Lösung (oder, wenn dies aus technischen Gründen nicht möglich ist, in der Wassersäule) gemessen worden ist. Die Konzentration soll nach einer Zeit der Äquilibrierung, jedoch vor Einbringen der Prüforganismen bestimmt werden.

In all diesen Fällen müssen im Verlauf der Prüfung weitere Messungen durchgeführt werden, um zu bestätigen, daß die Expositionskonzentrationen tatsächlich erreicht und die Qualitätskriterien erfuellt worden sind.

Der pH-Wert soll nicht um mehr als eine Einheit schwanken.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Reagenzien

1.6.1.1. Lösungen der Prüfsubstanzen

Die Stammansätze in den erforderlichen Konzentrationen werden durch Lösung der Prüfsubstanz in deionisiertem Wasser oder Wasser entsprechend 1.6.1.2. hergestellt.

Die gewählten Prüfkonzentrationen werden durch Verdünnung des Stammansatzes zubereitet. Werden hohe Konzentrationen geprüft, kann die Prüfsubstanz unmittelbar im Verdünnungswasser gelöst werden.

Die Substanzen sollten im allgemeinen nur bis zur Löslichkeitsgrenze geprüft werden. Bei einigen Substanzen (z. B. bei solchen mit geringer Wasserlöslichkeit oder hohem Pow oder solchen, die im Wasser eher eine stabile Dispersion als eine echte Lösung bilden), kann es angezeigt sein, eine Prüfkonzentration zu verwenden, die oberhalb der Löslichkeitsgrenze der Substanz liegt. Somit ist sichergestellt, daß die höchste lösliche/stabile Konzentration erreicht worden ist. Wichtig ist jedoch, daß diese Konzentration das Prüfsystem nicht auf sonstige Weise stört (z. B. durch Bildung eines Substanzfilms auf der Wasseroberfläche, durch den die Anreicherung des Wassers mit Sauerstoff verhindert wird).

Durch Ultraschalldispersion, Verwendung organischer Lösungsmittel und emulgierender oder dispergierender Mittel können Stammansätze von Prüfsubstanzen mit geringer Wasserlöslichkeit hergestellt oder deren Dispersion im Prüfmedium gefördert werden. Werden derartige Hilfsstoffe verwendet, müssen alle Prüfkonzentrationen die gleiche Menge des Hilfsstoffes enthalten und müssen zusätzliche Kontroll-Fische derselben Konzentration an Hilfsstoffen ausgesetzt werden, wie sie in der Prüfreihe verwendet wurde. Die Konzentration derartiger Hilfsstoffe sollte niedrig gehalten werden, in keinem Fall jedoch 100 mg.l 1 im Prüfmedium überschreiten.

Die Prüfung ist ohne eine Einstellung des pH-Wertes durchzuführen. Gibt es Anzeichen für eine deutliche Änderung des pH-Wertes, wird empfohlen, die Prüfung mit einer pH-Wert-Einstellung zu wiederholen und die Ergebnisse entsprechend zu protokollieren. In diesem Fall ist der pH-Wert des Stammansatzes auf den pH-Wert des Verdünnungswassers einzustellen, falls nicht bestimmte Gründe dagegen sprechen. Hierzu sind möglichst HCl und NaOH zu verwenden. Die pH-Wert-Einstellung muß so erfolgen, daß sich die Konzentration der Prüfsubstanz im Stammansatz nicht wesentlich ändert. Sollte sich durch die Einstellung eine chemische Reaktion oder eine physikalische Ausfällung des Prüfsubstanz ergeben, so muß diese Beobachtung im Prüfbericht protokolliert werden.

1.6.1.2. Prüfwasser

Für diese Prüfung ist zubereitetes Wasser zu verwenden (siehe Anlage 1 und Literaturstelle 2: ISO 6341). Um die Notwendigkeit einer Anpassung an die Prüfbedingungen zu vermeiden, wird empfohlen, für die Kultur Wasser ähnlicher Qualität (z. B. pH-Wert, Härte) wie für die Prüfung zu verwenden.

1.6.2. Geräte

Es sind die üblichen Geräte und Ausstattungen von Prüfeinrichtungen zu verwenden. Teile, die mit den Prüflösungen in Berührung kommen, sollten vorzugsweise aus Glas bestehen:

- Sauerstoffmeßgerät (mit Mikrölektrode oder einem anderen geeigneten Gerät zur Messung von gelöstem Sauerstoff in kleinen Proben);

- geeignetes Gerät zur Temperaturmessung;

- pH-Meßgerät;

- Gerät zur Bestimmung der Wasserhärte.

1.6.3. Prüforganismen

Daphnia magna ist die bevorzugte Art, obwohl auch Daphnia pulex verwendet werden kann. Die Versuchstiere sollen zu Beginn der Prüfung weniger als 24 Stunden alt, in der Prüfeinrichtung gezuechtet, frei von offensichtlichen Krankheiten und von bekannter Herkunft (z. B. Aufzucht, Vorbehandlungen usw.) sein.

1.6.4. Durchführung der Prüfung

Ein Vorversuch kann der eigentlichen Prüfung vorangehen. Dieser Vorversuch liefert Informationen über den in der eigentlichen Prüfung zu verwendenden Konzentrationsbereich.

Zusätzlich zu den Konzentrationen der Prüfsubstanz sind eine Kontrolle ohne die Prüfsubstanz und ggf. eine Kontrolle mit dem Hilfsstoff einzusetzen.

Die Daphnien werden der Prüfsubstanz wie im folgenden beschrieben ausgesetzt:

- Dauer: vorzugsweise 48 Stunden,

- Anzahl der Tiere: mindestens 20 je Konzentration, vorzugsweise aufgeteilt in 4 Gruppen von je 5 Daphnien oder 2 Gruppen von je 10 Daphnien,

- Besatz: Je Daphnie mindestens 2 ml Testlösung,

- Prüfkonzentration: Die Prüflösung ist unmittelbar vor dem Einsetzen der Daphnien zuzubereiten, möglichst nur mit Wasser als einzigem Lösungsmittel. Die Konzentrationen werden in geometrischer Reihe mit einem Faktor angesetzt, der 2,2 nicht überschreiten darf. Zusammen mit den Kontrollen sind Konzentrationen einzusetzen, die ausreichen, um nach 48 Stunden 0 % und 100 % Schwimmunfähigkeit hervorzurufen, sowie ein Bereich von dazwischenliegenden Konzentrationen, die die Berechnung des 48-Stunden-EC50-Wertes erlauben,

- Wasser: siehe 1.6.1.2.,

- Beleuchtung: ein Hell-Dunkel-Zyklus ist erwünscht,

- Temperatur: Die Temperatur muß zwischen 18 C und 22 C liegen. Für jede einzelne Prüfung hat sie jedoch innerhalb von 1 C konstant zu bleiben,

- Belüftung: Die Prüflösungen sollen nur leicht belüftet werden,

- Fütterung: keine.

Am Ende der Prüfung sind der pH-Wert und der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in den Kontrollen und in jeder Prüfkonzentration zu bestimmen. Der pH-Wert der Prüflösungen darf nicht verändert werden.

Flüchtige Verbindungen sind in randvoll gefuellten, geschlossenen Behältern zu untersuchen, die groß genug sind, um Sauerstoffmangel zu vermeiden.

Die Daphnien werden mindestens nach 24 Stunden und erneut nach 48 Stunden Expositionszeit untersucht.

Limit-Test

Unter Verwendung der bei diesem Prüfverfahren beschriebenen Methoden kann ein Limit-Test mit 100 mg.l 1 durchgeführt werden, um nachzuweisen, daß die EC50 über dieser Konzentration liegt.

Wenn die Substanz so beschaffen ist, daß eine Konzentration von 100 mg.l 1 im Prüfwasser nicht erreicht werden kann, ist der Limit-Test bei einer Konzentration durchzuführen, die der Löslichkeit der Substanz (oder der höchsten Konzentration, die eine stabile Dispersion bildet) im verwendeten Medium entspricht (vgl. auch Punkt 1.6.1.1.).

Der Limit-Test ist mit 20 Daphnien, die in zwei oder vier Gruppen unterteilt werden, und der gleichen Anzahl Kontrollen durchzuführen. Wenn Schwimmunfähigkeit eintritt, ist das vollständige Prüfverfahren anzuwenden.

2. DATEN UND AUSWERTUNG

Die Mortalität wird für jeden Zeitraum, in dem Beobachtungen protokolliert wurden (24 und 48 Stunden), auf Wahrscheinlichkeitspapier (mit logarithmischer Einteilung) gegen die Konzentration aufgetragen.

Soweit möglich, sollten die EC50 und der jeweilige Vertrauensbereich (p = 0,05) für jeden Beobachtungszeitraum nach Standardverfahren ermittelt werden. Diese Werte sind auf eine oder höchstens zwei signifikante Stelle(n) zu runden (Beispiele für das Runden auf zwei Stellen: 170 für 173,5; 0,13 für 0,127; 1,2 für 1,21).

Sollte der Verlauf der Konzentrations-Wirkungs-Kurve für eine Berechnung der EC50 zu steil sein, so reicht eine graphische Abschätzung dieses Wertes.

Ergeben zwei unmittelbar aufeinanderfolgende Konzentrationen, die sich durch den Faktor 2,2 unterscheiden, nur 0 % und 100 % Mortalität, so werden diese beiden Werte zur Angabe des Bereichs, in den die EC50 fällt, herangezogen.

Wird beobachtet, daß die Stabilität oder Homogenität der Prüfsubstanz nicht aufrechterhalten werden kann, so ist dies im Prüfbericht mitzuteilen und bei der Interpretation der Ergebnisse entsprechend zu berücksichtigen.

3. ABSCHLUSSBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Angaben über die verwendeten Organismen (wissenschaftlicher Name, Stamm, Zuechter oder Bezugsquelle, Vorbehandlungen, Aufzuchtverfahren - einschließlich Herkunft, Art und Menge der Nahrung, Häufigkeit der Fütterung);

- Herkunft des Verdünnungswassers und wichtige chemische Eigenschaften (pH-Wert, Härte, Temperatur);

- Bei Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit: Angabe der Methode zur Herstellung des Stammansatzes und der Prüflösungen;

- Konzentration aller Hilfsstoffe;

- Liste der verwendeten Konzentrationen sowie alle vorhandenen Informationen über die Stabilität der Prüfsubstanz in der Prüflösung bei den verwendeten Konzentrationen;

- bei Durchführung chemischer Analysen: Angabe der verwendeten Methoden und der Ergebnisse;

- ggf. Ergebnisse des Limit-Tests;

- Beschreibung der Prüfgeräte;

- Beleuchtungsverhältnisse;

- Konzentration des gelösten Sauerstoffs, pH-Werte, Temperatur der Prüflösungen;

- Nachweis, daß die Qualitätskriterien erfuellt sind;

- Tabelle der kumulativen Mortalität bei jeder Konzentration und bei der Kontrolle (ggf. auch bei der Kontrolle mit dem Hilfsstoff) zu den empfohlenen Beobachtungszeitpunkten (24 und 48 Stunden);

- graphische Darstellung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve am Ende der Prüfung;

- wenn möglich, die EC50-Werte für jeden empfohlenen Beobachtungszeitpunkt (möglichst mit 95 % Vertrauensbereich);

- verwendete statistische Verfahren zur Bestimmung der EC50-Werte;

- bei Verwendung einer Referenzsubstanz Angabe der Ergebnisse;

- höchste eingesetzte Prüfkonzentrationen ohne Mortalität im Prüfzeitraum;

- niedrigste eingesetzte Prüfkonzentration mit 100 % Mortalität im Prüfzeitraum.

4. LITERATUR

(1) ÖCD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.

(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera - crustacea) NFT 90 301 (January 1983).

(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudoplh, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen fur die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).

(6) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K.

(7) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, 99-113.

(8) Spragü, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(9) Spragü, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32.

(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM, 1977, STP 634, 65-84.

(11) Stepahn, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

Anlage 1

Zubereitetes Wasser

Beispiel für ein geeignetes Verdünnungswasser (nach ISO 6341)

Alle Chemikalien müssen analysenrein sein.

Das Wasser muß einwandfreies destilliertes oder deionisiertes Wasser mit einer Leitfähigkeit von weniger als 5 Scm 1 sein.

Die für die Destillation von Wasser verwendete Apparatur darf keine Kupferteile enthalten.

Stammlösungen

CaCl2.2 H2O (Calciumchlorid Dihydrat) 11,76 g in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffuellen

MgSO4.7 H2O (Magnesiumsulfat Heptahydrat) 4,93 g in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffuellen

NaHCO3 (Natriumhydrogencarbonat) 2,59 g in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffuellen

KCl (Kaliumchlorid) 0,23 g in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffuellen

Zubereitetes Verdünnungswasser

Je 25 ml der vier Stammlösungen mischen und mit Wasser auf 1 Liter auffuellen.

Solange belüften, bis die Konzentration an gelöstem Sauerstoff dem Luftsauerstoff-Sättigungswert entspricht.

Der pH-Wert muß 7,8 0,2 betragen.

Falls erforderlich, ist der pH-Wert mit NaOH (Natriumhydroxid) oder HCl (Salzsäure) einzustellen.

Dieses Verdünnungswasser lässt man 12 Stunden stehen; eine weitere Belüftung ist nicht erforderlich.

Die Summe der Ca- und Mg-Ionen in dieser Lösung beträgt 2,5 mmol.l 1. Das Verhältnis der Ca- zu den Mg-Ionen beträgt 4 : 1 und das der Na- zu den K-Ionen 10 : 1. Die Gesamtalkalinität dieser Lösung liegt bei 0,8 mmol.l 1.

Eine abweichende Zubereitung des Verdünnungswassers darf die Zusammensetzung oder die Eigenschaften des Wassers nicht verändern.

Anlage 2

Zusammenfassung der Ergebnisse eines EWG-Ring-Tests, durchgeführt im Jahre 1978 (vgl. auch (2))

Achtung: Ziel dieses Ring-Tests war die Bestimmung der 24-Stunden-EC50.

Verwendete Substanzen:

1) Kaliumdichromat

2) Tetrapropylbenzolsulfonsäure

3) Tetrapropylbenzolsulfonsäure, Natriumsalz

4) Trichlor-2,4,5-phenoxy-Essigsäure, Kaliumsalz

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Anlage 3

Beispiel für eine Konzentrations-Immobilisierungskurve

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

>ENDE EINES SCHAUBILD>

Beispiel für die Bestimmung der EC50 auf Wahrscheinlichkeitspapier

C.3. ALGENINHIBITIONSTEST

1. METHODE

1.1. EINLEITUNG

Mit diesem Test soll die Wirkung einer Substanz auf das Wachstum einer einzelligen Grünalgenart bestimmt werden. Mit verhältnismässig kurzen Tests (72 Stunden) lässt sich die Wirkung über mehrere Generationen ermitteln. Dieses Verfahren kann für die Anwendung bei zahlreichen einzelligen Algenarten variiert werden. In diesem Fall ist dem Prüfbericht eine Beschreibung des verwendeten Verfahrens beizufügen.

Dieses Verfahren lässt sich am einfachsten auf wasserlösliche Substanzen anwenden, von denen angenommen werden kann, daß sie unter den Prüfbedingungen im Wasser bleiben.

Das Verfahren kann für Substanzen verwendet werden, die keinen direkten Einfluß auf die Messung des Algenwachstums haben.

Soweit möglich, sollten Angaben über die Wasserlöslichkeit, den Dampfdruck, die chemische Stabilität, die Dissoziationskonstanten und die biologische Abbaubarkeit der Prüfsubstanz vor dem Beginn der Prüfung vorhanden sein.

Weitere Angaben (z. B. Strukturformel, Reinheitsgrad, Art und Prozentanteil signifikanter Verunreinigungen, Vorhandensein und Menge von Zusätzen sowie der n-Oktanol/Wasser-Verteilungsköffizient) sind sowohl bei der Planung der Prüfung als auch bei der Interpretation der Prüfergebnisse zu berücksichtigen.

1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN

Zelldichte: Anzahl der Zellen pro Milliliter;

Wachstum: Zunahme der Zelldichte im Prüfzeitraum;

Wachstumsrate: Zunahme der Zelldichte pro Zeiteinheit;

EC50: bei diesem Verfahren diejenige Konzentration der Prüfsubstanz, die im Vergleich zur Kontrolle zu einer 50%igen Abnahme entweder des Wachstums (EbC50) oder der Wachtumsrate (ErC50) führt;

NÖC (no observed effect concentration): bei diesem Verfahren die höchste geprüfte Konzentration, bei der im Vergleich zur Kontrolle keine signifikante Wachstumshemmung beobachtet wird.

Alle Konzentrationen der Prüfsubstanz sind in Gewicht/Volumen (mg.l 1) anzugeben. Sie können auch als Gewichtsanteile (mg.kg 1) angegeben werden.

1.3. REFERENZSUBSTANZEN

Eine Referenzsubstanz kann getestet werden, um nachzuweisen, daß sich die Empfindlichkeit der geprüften Art unter den Bedingungen der Prüfeinrichtung nicht wesentlich geändert hat.

Wird eine Referenzsubstanz getestet, so sind die Ergebnisse im Prüfbericht anzugeben. Kaliumdichromat kann als Referenzsubstanz verwendet werden, doch kann seine Farbe die für die Zellen zur Verfügung stehende Lichtqualität und -intensität und ggf. auch die spektrophotometrischen Bestimmungen beeinträchtigen. Kaliumdichromat ist in einem internationalen Ring-Test (vgl. Literaturstelle (3) und Anlage 2) verwendet worden.

1.4. PRINZIP DER METHODE

Es kann ein Limit-Test mit 100 mg.l 1 durchgeführt werden, um nachzuweisen, daß die EC50 über dieser Konzentration liegt.

Exponentiell wachsende Kulturen ausgewählter Grünalgen werden verschiedenen Konzentrationen der Prüfsubstanz über mehrere Generationen und unter genau definierten Bedingungen ausgesetzt.

Die Prüflösungen werden über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert. In dieser Zeit wird die Zelldichte in jeder Lösung mindestens alle 24 Stunden gemessen. Die Hemmung des Wachstums wird im Vergleich zu einer Kontrollkultur bestimmt.

1.5. QUALITÄTSKRITERIEN

Die Qualitätskriterien gelten sowohl für den Limit-Test als auch für das vollständige Prüfverfahren.

Die Zelldichte in den Kontrollkulturen sollte innerhalb von drei Tagen um einen Faktor von mindestens 16 zugenommen haben.

Die Konzentration der Prüfsubstanz soll über den gesamten Prüfzeitraum bei bis zu 80 % der Anfangskonzentration gehalten werden.

Bei Substanzen, die im Prüfmedium leicht löslich sind und stabile Lösungen ergeben, d. h. Lösungen, die sich nicht in signifikantem Masse verfluechtigen oder nicht in einem solchen Masse abgebaut, hydrolisiert oder adsorbiert werden, kann die Anfangskonzentration als der nominalen Konzentration gleichwertig angesehen werden. Es ist nachzuweisen, daß die Konzentrationen über den gesamten Prüfzeitraum aufrechterhalten und die Qualitätskriterien erfuellt worden sind.

Bei Substanzen, die

(i) im Prüfmedium schwer löslich sind oder

(ii) stabile Emulsionen oder Dispersionen bilden können oder

(iii) in wäßrigen Lösungen nicht stabil sind,

soll die Anfangskonzentration diejenige Konzentration sein, die bei Prüfbeginn gemessen worden ist. Die Konzentration soll nach einer Zeit der Äquilibrierung bestimmt werden.

In all diesen Fällen müssen im Verlauf der Prüfung weitere Messungen durchgeführt werden, um zu bestätigen, daß die Expositionskonzentrationen tatsächlich erreicht und die Qualitätskriterien erfuellt worden sind.

Es wird davon ausgegangen, daß beachtliche Mengen der Prüfsubstanz während des Prüfzeitraums in die Algenbiomasse aufgenommen werden. Um daher nachweisen zu können, daß die oben genannten Qualitätskriterien erfuellt worden sind, sollten sowohl die in die Algenbiomasse aufgenommene Substanz als auch die Substanz in der Lösung (oder, wenn dies aus technischen Gründen nicht möglich ist, in der Wassersäule) gemessen werden. Da jedoch die Bestimmung der Substanzkonzentration in der Algenbiomasse grössere technische Schwierigkeiten verursachen kann, kann man die Erfuellung der Qualitätskriterien durch Mitführen eines Prüfgefässes mit der höchsten Substanzkonzentration - jedoch ohne Algen - sowie durch Messung der Konzentrationen in der Lösung (oder, wenn technisch nicht möglich, in der Wassersäule) bei Prüfbeginn und bei Prüfende nachweisen.

1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE

1.6.1. Reagenzien

1.6.1.1. Lösungen der Prüfsubstanzen

Die Stammansätze in den erforderlichen Konzentrationen werden durch Lösung der Prüfsubstanz in deionisiertem Wasser oder Wasser entsprechend 1.6.1.2. hergestellt.

Die gewählten Prüfkonzentrationen werden durch Hinzufügen geeigneter aliquoter Teile zu den Algenvorkulturen hergestellt (siehe Anlage 1). Die Substanzen sollten im allgemeinen nur bis zur Löslichkeitsgrenze geprüft werden. Bei einigen Substanzen (z. B. bei solchen mit geringer Wasserlöslichkeit oder hohem Pow oder solchen, die im Wasser eher eine stabile Dispersion als eine echte Lösung bilden), kann es angezeigt sein, eine Prüfkonzentration zu verwenden, die oberhalb der Löslichkeitsgrenze der Substanz liegt, um sicherzustellen, daß die höchste lösliche/stabile Konzentration erreicht worden ist. Wichtig ist jedoch, daß diese Konzentration das Prüfsystem nicht auf sonstige Weise stört (z. B. durch Bildung eines Substanzfilms auf der Wasseroberfläche, durch den die Anreicherung des Wassers mit Sauerstoff verhindert wird).

Durch Ultraschalldispersion, Verwendung organischer Lösungsmittel und emulgierender oder dispergierender Mittel können Stammansätze von Prüfsubstanzen mit geringer Wasserlöslichkeit hergestellt oder deren Dispersion im Prüfmedium gefördert werden. Werden derartige Hilfsstoffe verwendet, müssen alle Prüfkonzentrationen die gleiche Menge des Hilfsstoffes enthalten und müssen zusätzliche Kontrollen derselben Konzentration an Hilfsstoffen ausgesetzt werden, wie sie in der Prüfreihe verwendet wurde. Die Konzentration derartiger Hilfsstoffe sollte niedrig gehalten werden, in keinem Fall jedoch 100 mg.l 1 im Prüfmedium überschreiten.

Die Prüfung ist ohne eine Einstellung des pH-Wertes durchzuführen. Gibt es Anzeichen für eine deutliche Änderung des pH-Wertes, wird empfohlen, die Prüfung mit einer pH-Wert-Einstellung zu wiederholen und die Ergebnisse entsprechend zu protokollieren. In diesem Fall ist der pH-Wert des Stammansatzes auf den pH-Wert des Verdünnungswassers einzustellen, falls nicht bestimmte Gründe dagegen sprechen. Hierzu sind möglichst HCl und NaOH zu verwenden. Die pH-Wert-Einstellung muß so erfolgen, daß sich die Konzentration der Prüfsubstanz im Stammansatz nicht wesentlich ändert. Sollte sich durch die Einstellung eine chemische Reaktion oder eine physikalische Ausfällung des Prüfsubstanz ergeben, so muß diese Beobachtung im Prüfbericht protokolliert werden.

1.6.1.2. Prüfmedium

Das Wasser muß einwandfreies destilliertes oder deionisiertes Wasser mit einer Leitfähigkeit von weniger als 5 Scm 1 sein. Die für die Destillation von Wasser verwendete Apparatur darf keine Kupferteile enthalten.

Es wird das folgende Medium empfohlen.

Vier Stammansätze werden nach der folgenden Tabelle hergestellt. Die Stammansätze werden durch Membranfiltrierung oder durch autoklavieren sterilisiert und bei 4 C im Dunkeln aufbewahrt. Stammansatz Nr. 4 sollte nur durch Membranfiltrierung sterilisiert werden. Diese Stammansätze werden verdünnt, um die endgültigen Nährkonzentrationen in den Prüflösungen zu erhalten.

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Der pH-Wert des Mediums nach der Äquilibrierung mit Luft liegt bei etwa 8.

1.6.2. Geräte

- Übliche Laborgeräte,

- Prüfgefässe mit geeignetem Volumen (z. B. sind konische Flaschen mit 250 ml Volumen geeignet, wenn das Volumen der Prüflösung 100 ml beträgt). Alle Prüfflaschen sollten nach Material und Grösse identisch sein.

- Kulturinkubator: Schrank oder Kammer, in denen eine Temperatur zwischen 21 und 25 C bei 2 C gehalten und eine ständige gleichförmige Beleuchtung im Spektralbereich zwischen 400 und 700 nm gesichert werden kann. Wenn die Algen in den Kontrollkulturen die empfohlenen Wachstumsraten erreicht haben, kann angenommen werden, daß die Wachstumsbedingungen, einschließlich der Lichtintensität, geeignet waren.

Bei Prüflösungen mit durchschnittlicher Konzentration wird eine Lichtintensität zwischen 60 und 120 E.m 2.s 1 (35 bis 70 1018 Photonen.m 2.s 1) empfohlen; die Messung wird unter Verwendung eines geeigneten Detektors im Bereich zwischen 400 und 700 nm vorgenommen. Für in Lux-Einheiten geeichte Lichtmessinstrumente ist ein äquivalenter Bereich von 6 000 bis 10 000 lx akzeptabel.

Die Lichtintensität kann durch Verwendung von vier bis sieben Fluoreszenzlampen (30 W) des Typs Universalweiß (Farbtemperatur etwa 4 300 K) erreicht werden, die 0,35 m von der Algenkultur entfernt sind.

- Messungen der Zelldichte sind mit Hilfe eines direkten Zählverfahrens für lebende Zellen (z. B. Mikroskop mit Zählkammern) durchzuführen. Andere Verfahren (Photometrie, Trübungsmessung usw.) können verwendet werden, wenn diese eine ausreichende Empfindlichkeit und eine erwiesenermassen ausreichende Korrelation zur Zelldichte haben.

1.6.3. Prüforganismen

Es wird vorgeschlagen, eine schnellwachsende Grünalgenart zu verwenden, die sich für Kultur- und Prüfzwecke eignet. Dabei sind folgende Arten zu bevorzugen:

- Selenastrum capricornutum, z. B. ATCC 22662 oder CCAP 278/4,

- Scenedesmus subspicatus, z. B. 86.81 SAG,

Anmerkung:

ATCC = American Type Culture Collection (U.S.A.)

CCAP = Culture Centre of Algä and Protozoa (U.K.)

SAG = Sammlung Algenkulturen (Göttingen, Deutschland)

Wenn andere Arten verwendet werden, ist der Stamm anzugeben.

1.6.4. Durchführung der Prüfung

Der Konzentrationsbereich, in dem Wirkungen zu erwarten sind, wird anhand von Ergebnissen aus Vorversuchen ermittelt.

Die beiden Wachstumsparameter (Biomasse und Wachstumsrate) können zu stark voneinander abweichenden Werten für die Wachstumshemmung führen; beide sollten im Vorversuch verwendet werden, um sicherzustellen, daß die geometrische Reihe der Konzentrationen die Ermittlung sowohl der EbC50 als auch der ErC50 möglich macht.

Anfängliche Zelldichte

Es wird empfohlen, daß die anfängliche Zelldichte bei Selenastrum capricornutum und Scenedesmus subspicatus in den Testkulturen bei etwa 104 Zellen/ml liegt. Wenn andere Arten verwendet werden, sollte die Biomasse einen vergleichbaren Wert aufweisen.

Konzentrationen der Prüfsubstanz

Für die Prüfung werden mindestens fünf Konzentrationen in geometrischer Reihe bei einem Konzentrationsverhältnis, das nicht über 2,2 liegen darf, hergestellt. Die niedrigste geprüfte Konzentration sollte keine feststellbare Wirkung auf das Algenwachstum haben. Die höchste geprüfte Konzentration sollte im Vergleich zu den Kontrollen zu einer mindestens 50%igen Wachstumshemmung oder - besser noch - zu einem vollständigen Wachstumsstillstand führen.

Wiederholungen und Kontrollen

Das Prüfprotokoll sollte für jede Prüfkonzentration drei Wiederholungen vorsehen. Es werden drei Kontrollen ohne Prüfsubstanz mitgeführt, ggf. auch drei Kontrollen mit der Hilfssubstanz. Wenn es gerechtfertigt erscheint, kann das Prüfprotokoll dahin gehend geändert werden, daß eine höhere Anzahl an Konzentrationen und eine geringere Anzahl an Wiederholungen pro Konzentration durchgeführt wird.

Versuchsausführung

Prüfkulturen, die die gewünschten Konzentrationen der Prüfsubstanz und die gewünschte Menge des Algeninokulums enthalten, werden durch Hinzufügen aliquoter Teile der Stammlösungen der Prüfsubstanz zu geeigneten Mengen der Algenvorkulturen hergestellt (siehe Anlage 1).

Die Kulturflaschen werden geschüttelt und in den Inkubator gestellt. Die Algenzellen werden durch Schütteln, Rühren oder Belüften in Suspension gehalten, um den Gasaustausch zu verbessern und die Schwankung des pH-Wertes in den Prüflösungen zu reduzieren. Die Kulturen sind bei einer Temperatur zwischen 21 und 25 C (innerhalb einer Toleranz von 2 C) zu halten.

Die Zelldichte in jeder Flasche wird mindestens 24, 48 und 72 Stunden nach Prüfbeginn bestimmt. Das filtrierte Algenmedium, das die Prüfsubstanz in der entsprechenden Konzentration enthält, wird zur Bestimmung des Hintergrunds verwendet, wenn zur Zelldichtemessung andere Methoden als direkte Zählverfahren Anwendung finden.

Der pH-Wert wird zu Beginn der Prüfung und nach 72 Stunden gemessen.

Der pH-Wert der Kontrollen sollte während der Prüfung normalerweise nicht um mehr als 1,5 Einheiten schwanken.

Prüfung fluechtiger Substanzen

Es gibt bislang noch kein allgemein anerkanntes Verfahren zur Prüfung fluechtiger Substanzen. Wenn sich eine Substanz bekanntermassen leicht verfluechtigt, können geschlossene Prüfflaschen mit mehr Luftraum verwendet werden. Bei der Berechnung des Luftraums der geschlossenen Flaschen sollte an die Möglichkeit eines CO2-Mangels gedacht werden. Es gibt bereits Vorschläge für Änderungen dieses Verfahrens (siehe (4)).

Es sollte versucht werden, die in der Lösung verbleibende Substanzmenge zu bestimmen. Äusserste Vorsicht ist bei der Interpretation der Ergebnisse von Prüfungen mit fluechtigen Substanzen bei Verwendung geschlossener Systeme geboten.

Limit-Test

Unter Verwendung der bei diesem Prüfverfahren beschriebenen Methoden kann ein Limit-Test mit 100 mg.l 1 durchgeführt werden, um nachzuweisen, daß die EC50 über dieser Konzentration liegt.

Wenn die Substanz so beschaffen ist, daß eine Konzentration von 100 mg.l 1 im Prüfwasser nicht erreicht werden kann, ist der Limit-Test bei einer Konzentration durchzuführen, die der Löslichkeit der Substanz (oder der höchsten Konzentration, die eine stabile Dispersion bildet) im verwendeten Medium entspricht (vgl. auch Punkt 1.6.1.1.).

Der Limit-Test ist mindestens dreifach und mit der gleichen Anzahl von Kontrollen durchzuführen. Die beiden Wachstumsparameter (Biomasse und Wachstumsrate) sind für den Limit-Test zu verwenden.

Wenn bei einem Limit-Test im Vergleich zur Kontrolle eine mittlere Abnahme der Biomasse oder der Wachstumsrate um 25 % oder darüber festgestellt wird, ist das vollständige Prüfverfahren anzuwenden.

2. DATEN UND AUSWERTUNG

Die gemessene Zelldichte in den Prüfkulturen und den Kontrollen wird zusammen mit den Konzentrationen der Prüfsubstanz und den Meßzeiten tabellarisch zusammengefasst. Zur Erzeugung der Wachstumskurven wird der Mittelwert der Zelldichte für jede Prüfkonzentration und für die Kontrollen gegen die Zeit (0-72 h) aufgetragen.

Zur Bestimmung des Konzentrations-Wirkungs-Verhältnisses sollten die beiden folgenden Verfahren verwendet werden. Einige Substanzen können das Wachstum bei niedrigen Konzentrationen fördern. Es sind nur solche Datenpunkte zu berücksichtigen, die eine Hemmwirkung zwischen 0 und 100 % angeben.

2.1. VERGLEICH DER FLÄCHEN UNTER DEN WACHSTUMSKURVEN

Die Fläche zwischen den Wachstumskurven und der horizontalen Linie N = N0 kann nach folgender Formel berechnet werden:

A =N1N02 t1 +N1 + N22N02 (t2t1) + +Nn 1 + Nn 2N02 (tn tn 1)

wobei A = Fläche,

N0 = Anzahl der Zellen/ml zum Zeitpunkt t0 (Prüfbeginn),

N1 = gemessene Anzahl der Zellen/ml zum Zeitpunkt t1,

Nn = gemessene Anzahl der Zellen/ml zum Zeitpunkt tn,

t1 = Zeitpunkt der ersten Messung nach Prüfbeginn,

tn = Zeitpunkt der n. Messung nach Prüfbeginn,

n = Anzahl der nach Prüfbeginn durchgeführten Messungen.

Die prozentuale Hemmung des Zellwachstums für jede Konzentration der Prüfsubstanz (IA) wird nach folgender Formel berechnet:

IA = Ac AtAc 100

wobei Ac = Fläche zwischen der Wachstumskurve der Kontrolle und der horizontalen Linie N = N0.

At = Fläche zwischen der Wachstumskurve bei der Konzentration t und der horizontalen Linie N = N0.

Die IA-Werte werden auf semilogarithmischem Papier oder auf semilogarithmischem Wahrscheinlichkeitspapier gegen die entsprechenden Konzentrationen aufgetragen. Bei Verwendung von Wahrscheinlichkeitspapier wird die Gerade - entweder mit blossem Auge oder über Regressionsrechnung - an die Meßwerte angepasst.

Die EC50 wird aus der Regressionsgeraden durch Ablesen der Konzentration, die einer 50%igen Hemmung entspricht (IA = 50 %), ermittelt. Um diesen Wert im Zusammenhang mit diesem Berechnungsverfahren eindeutig zu kennzeichnen, wird vorgeschlagen, das Symbol EbC50 zu verwenden. Es ist wichtig, daß die EbC50 zusammen mit dem entsprechenden Expositionszeitraum angegeben wird, z. B. EbC50 (0-72 h).

2.2. VERGLEICH ZWISCHEN DEN WACHSTUMSRATEN

Die durchschnittliche spezifische Wachstumsrate () für Kulturen mit exponentiellem Wachstum kann ermittelt werden als

m = ln Nn ln N0tn t0

wobei t0 der Zeitpunkt zu Prüfbeginn ist.

Die durchschnittliche spezifische Wachstumsrate kann aber auch aus der Neigung der Regressionsgeraden in einer ln N-Zeit-Darstellung abgeleitet werden.

Die prozentuale Hemmung der spezifischen Wachstumsrate bei den einzelnen Konzentrationen der Prüfsubstanz (It) wird nach folgender Formel berechnet:

Imt = mc mtmc 100

wobei

c = mittlere spezifische Wachstumsrate der Kontrolle

t = mittlere spezifische Wachstumsrate bei der Prüfkonzentration t

Die prozentuale Verminderung der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate bei den einzelnen Konzentrationen gegenüber dem Kontrollwert wird gegen den Logarithmus der Konzentration aufgetragen. Die EC50 lässt sich aus der daraus entstehenden Kurve ablesen. Um die mit diesem Verfahren abgeleitete EC50 eindeutig zu kennzeichnen, wird vorgeschlagen, das Symbol ErC50 zu verwenden. Die Meßzeitpunkte sind anzugeben, d. h. wenn sich der Wert auf Zeitpunkte zwischen 0 und 72 Stunden bezieht, wird das Symbol ErC50 (0-72 h) verwendet.

Anmerkung: "Spezifische Wachstumsrate" ist ein logarithmischer Ausdruck, und kleine Veränderungen in der Wachstumsrate können zu grossen Veränderungen in der Biomasse führen. Die Werte für EbC und ErC sind daher numerisch nicht miteinander vergleichbar.

2.3. BERECHNUNG DER NÖC

Die "no observed effect concentration" (NÖC) wird mit Hilfe eines geeigneten statistischen Verfahrens für den multiplen Vergleich (z. B. Varianzanalyse, Dunnett-Test) bestimmt, wobei die einzelnen Werte der Wiederholungen für die Flächen unter den Wachstumskurven A (siehe Punkt 2.1) oder für die spezifischen Wachstumsraten (siehe Punkt 2.2) verwendet werden.

3. ABSCHLUSSBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Prüfsubstanz: chemische Zusammensetzung;

- Prüforganismen: Herkunft, Laborkultur, Stammnummer, Art der Herstellung der Kultur;

- Prüfbedingungen:

- Zeitpunkt des Prüfbeginns und des Prüfendes sowie Dauer der Prüfung,

- Temperatur,

- Zusammensetzung des Mediums,

- Kulturinkubator,

- pH-Wert der Lösungen bei Prüfbeginn und Prüfende (Wenn der pH-Wert um mehr als 1,5 Einheiten abweicht, ist dafür eine Erklärung beizufügen),

- Trägersubstanz und Verfahren, mit dem die Prüfsubstanz gelöst wird, sowie Konzentration der Trägersubstanz in den Prüflösungen,

- Lichtintensität und -qualität,

- geprüfte Konzentrationen (gemessen oder nominal).

- Ergebnisse:

- Zelldichte für jede Flasche pro Meßzeitpunkt und Verfahren zur Messung der Zelldichte,

- Mittelwerte der Zelldichte,

- Wachstumskurven,

- graphische Darstellung des Konzentrations-Wirkungs-Verhältnisses,

- EC-Werte und Berechnungsverfahren,

- NÖC,

- sonstige beobachtete Wirkungen.

4. LITERATUR

(1) ÖCD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag "Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus", in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

(3) ISO 8692 - Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

(4) S. Galassi and M. Vighi - Chemosphere, 1981, vol. 10, 1123-1126.

Anlage 1

Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung von Algenkulturen

Allgemeine Beobachtungen

Zweck der Herstellung von Kulturen anhand des folgenden Verfahrens ist der Erhalt von Algenkulturen für Toxizitätsprüfungen.

Es sind geeignete Verfahren anzuwenden, um sicherzustellen, daß die Algenkulturen nicht mit Bakterien infiziert sind (ISO 4833). Axenische Kulturen mögen wünschenswert sein, notwendig sind Kulturen mit nur einer Algenart.

Alle Schritte sind unter sterilen Bedingungen durchzuführen, um eine Kontamination mit Bakterien und anderen Algen zu vermeiden. Kontaminierte Kulturen sind zurückzuweisen.

Verfahren zum Erhalt von Algenkulturen Zubereitung der Nährlösungen (Medien):

Das Medium kann durch Verdünnung von konzentrierten Stammnährlösungen zubereitet werden. Bei einem festen Medium wird 0,8 % Agar zugefügt. Das verwendete Medium muß steril sein. Die Autoklav-Sterilisierung kann zu einem Verlust an NH3 führen.

Stammkultur:

Als Stammkulturen werden kleine Algenkulturen verwendet, die regelmässig in frisches Medium eingebracht und dort als Ausgangsprüfmaterial verwendet werden. Wenn die Kulturen nicht regelmässig verwendet werden, werden sie auf geneigte Agarröhrchen aufgebracht. Sie werden mindestens alle zwei Monate einmal in ein frisches Medium übertragen.

Die Stammkulturen werden in konischen Flaschen kultiviert, die das entsprechende Medium (Volumen etwa 100 ml) enthalten. Werden die Algen bei 20 C und ständiger Beleuchtung inkubiert, ist ein wöchentlicher Transfer erforderlich.

Während des Transfers wird eine bestimmte Menge der "alten" Kultur mit sterilen Pipetten in eine Flasche mit frischem Medium gebracht, so daß bei schnell wachsenden Arten die Anfangskonzentration etwa 100 mal niedriger ist als die der alten Kultur.

Die Wachstumsrate einer Art kann mit Hilfe der Wachstumskurve bestimmt werden. Wenn diese bekannt ist, lässt sich diejenige Dichte ermitteln, bei der die Kultur in das neue Medium übertragen werden sollte. Dies muß vor der Absterbephase der Kultur geschehen.

Vorkultur

Die Vorkultur soll eine entsprechende Menge Algen ergeben, die als Inokulum für die Prüfkulturen verwendet werden können. Die Vorkultur wird unter den Prüfbedingungen inkubiert und normalerweise bei weiterhin exponentiellem Wachstum nach einer Inkubationszeit von etwa drei Tagen verwendet. Wenn die Algenkulturen deformierte oder anomale Zellen enthalten, sind sie zu verwerfen.

Anlage 2

Der ISO-Standard 8692 (Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus und Selenastrum capricornutum) gibt folgende Ergebnisse aus einem von 16 Labors durchgeführten Test mit Kaliumdichromat an:

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

C.4. BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT - BESTIMMUNG DER "LEICHTEN" BIOLOGISCHEN ABBAUBARKEIT

TEIL I. ALLGEMEINES

I.1. EINLEITUNG

Es werden sechs Prüfverfahren als "Screening"-Untersuchungen zur leichten biologischen Abbaubarkeit

von chemischen Substanzen in einem äroben wäßrigen Medium beschrieben:

(a) DOC-Die Away Test - Abnahme von gelöstem organischem Kohlenstoff (DOC) (1) (Methode C.4-A)

(b) Modifizierter ÖCD-Screening-Test - Abnahme von gelöstem organischem Kohlenstoff (Methode C.4-B)

(c) CO2-Entwicklungstest (Modifizierter Sturm-Test) (Methode C.4-C)

(d) Manometrischer Respirationstest (Methode C.4-D)

(e) Geschlossener Flaschentest (Methode C.4-E)

(f) MITI-Test (Ministry of International Trade and Industry - Japan) (Methode C.4-F)

Teil I der Methode enthält allgemeine Überlegungen sowie Anmerkungen, die für alle sechs Prüfverfahren gelten. Spezielle Ausführungen zu den einzelnen Prüfverfahren werden in den Teilen II bis VII gemacht. Die Anhänge enthalten Definitionen, Formeln und Übersichtsmaterial.

Ein im Jahre 1988 im Bereich der ÖCD-Länder durchgeführter Ring-Test hat ergeben, daß mit den Prüfverfahren übereinstimmende Ergebnisse erzielt werden. Dennoch wird im Einzelfall, je nach den physikalischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, das eine oder das andere Verfahren vorzuziehen sein.

I.2. AUSWAHL DES GEEIGNETEN VERFAHRENS

Um das geeignetste Verfahren auszuwählen, sind Angaben über die Löslichkeit, den Dampfdruck und die Adsorption der chemischen Substanz erforderlich. Zur Berechnung der theoretischen Werte und/oder zur Kontrolle der gemessenen Parameter (z. B. ThSB, ThCO2, DOC, TOC, CSB - siehe Anhänge I und II) müssen chemische Struktur oder Formel bekannt sein.

Prüfsubstanzen, die mindestens 100 mg/l wasserlöslich sind, können mit jedem beliebigen der genannten Verfahren geprüft werden, sofern sie nicht fluechtig und nicht adsorbierend sind. Geeignete Verfahren für schwer wasserlösliche, fluechtige oder adsorbierende chemische Substanzen sind in Tabelle 1 angegeben. Der Umgang mit schwer wasserlöslichen und fluechtigen Substanzen ist in Anhang III beschrieben. Mässig fluechtige Substanzen lassen sich nach dem DOC-Die Away Test prüfen, wenn die Prüfgefässe (die mit einem geeigneten Stopfen verschlossen sein müssen) über ausreichenden Gasraum verfügen. In diesem Fall ist hier eine abiotische Kontrolle vorzusehen, um mögliche physikalische Verluste zu berücksichtigen.

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

(1) DOC = dissolved organic carbon

Zur Interpretation der erzielten Ergebnisse sind Angaben zur Reinheit oder zu den relativen Anteilen der Hauptbestandteile der Prüfsubstanz erforderlich, insbesondere wenn es sich um niedrige oder marginale Werte handelt.

Angaben zur Bakterientoxizität der Prüfsubstanz (Anhang IV) können bei der Wahl geeigneter Prüfkonzentrationen zweckdienlich und bei der richtigen Interpretation geringer biologischer Abbauwerte wichtig sein.

I.3. REFERENZSUBSTANZEN

Zur Überprüfung des Verfahrens werden Referenzsubstanzen getestet, die die Kriterien für eine leichte biologische Abbaubarkeit erfuellen; dazu wird ein geeignetes Prüfgefäß parallel zur normalen Prüfreihe mitgeführt.

Geeignete Chemikalien sind Anilin (frisch destilliert), Natriumacetat und Natriumbenzoat. Diese Referenzsubstanzen werden bei diesen Verfahren durchweg abgebaut, auch wenn kein Inokulum hinzugefügt wird.

Es ist vorgeschlagen worden, daß eine Referenzsubstanz gesucht werden sollte, die biologisch leicht abgebaut wird, aber die Zugabe eines Inokulums erfordert. Als eine solche Substanz wurde Kaliumhydrogenphthalat vorgeschlagen, doch steht ein entsprechender Nachweis noch aus, bevor es als Referenzsubstanz akzeptiert werden kann.

Bei den Respirationstests können stickstoffhaltige Verbindungen die Sauerstoffaufnahme infolge Nitrifikation beeinflussen (siehe Anhänge II und V).

I.4. PRINZIP DER METHODE

Eine Lösung oder Suspension der Prüfsubstanz in einem mineralischen Medium wird unter äroben Bedingungen im Dunkeln oder bei diffuser Beleuchtung angeimpft und bebrütet. Die DOC-Menge in der Prüflösung, die aus dem Inokulum stammt, muß im Vergleich zu der DOC-Menge aus der Prüfsubstanz so gering wie möglich sein. Die endogene Aktivität des Inokulums wird durch Mitführen paralleler Blindproben mit Inokulum aber ohne Prüfsubstanz in der Lösung berücksichtigt, obwohl die endogene Aktivität der Zellen in Gegenwart der Substanz nicht genau dieselbe sein wird wie in der endogenen Kontrolle. Eine Referenzsubstanz wird parallel dazu eingesetzt, um den Verlauf der Vorgänge zu kontrollieren.

Im allgemeinen wird der Abbau durch Bestimmung von Parametern (z. B. DOC-Abnahme, CO2-Erzeugung und Sauerstoffaufnahme) ermittelt; entsprechende Messungen werden in ausreichenden Abständen vorgenommen, um Beginn und Ende des Bioabbaus zu identifizieren. Automatische Respirometer gestatten eine fortlaufende Messung. Mitunter wird der DOC-Wert zusätzlich zu einem weiteren Parameter gemessen, im allgemeinen aber nur zu Beginn und am Ende des Tests. Zur Beurteilung des Primärabbaus der Prüfsubstanz und zur Bestimmung der Konzentration eventueller Abbauprodukte können auch spezifische Analysen durchgeführt werden. (Beim MITI-Test sind diese obligatorisch).

Normalerweise beträgt die Testdauer 28 Tage. Die Tests können jedoch auch vorzeitig abgebrochen werden, wenn die biologische Abbaukurve über mindestens drei Messungen ein Plateau erreicht hat. Eine Verlängerung der Tests über 28 Tage hinaus ist ebenfalls möglich, wenn aus der Kurve zu ersehen ist, daß der biologische Abbau eingesetzt hat, das Plateau aber am 28. Tag noch nicht erreicht ist.

I.5. QUALITÄTSKRITERIEN

I.5.1. Reproduzierbarkeit

Wegen der Spezifität des biologischen Abbaus und der als Inokula verwendeten Bakterienmischpopulationen sind die Messungen mindestens in doppelten Ansätzen durchzuführen.

Es ist allgemein bekannt, daß die Unterschiede zwischen Doppelmessungen um so kleiner sind, je grösser die Konzentration der dem Prüfmedium anfänglich hinzugefügten Mikroorganismen war. Ringtests haben auch gezeigt, daß zwischen den in verschiedenen Prüfeinrichtungen erzielten Ergebnissen grosse Unterschiede bestehen können, doch wird normalerweise eine gute Übereinstimmung erreicht, wenn biologisch leicht abbaubare Substanzen verwendet werden.

I.5.2. Gültigkeit des Versuchs

Ein Versuch wird dann als gültig angesehen, wenn die Extremwerte der Wiederholungsmessungen für die Abnahme der Prüfsubstanz nicht mehr als 20 % voneinander abweichen, am Plateau, Testende oder am Ende des 10-Tage-Fensters, und wenn der prozentuale Abbau der Referenzsubstanz das Plateau für leichte biologische Abbaubarkeit innerhalb von 14 Tagen erreicht hat. Ist eine der beiden Bedingungen nicht erfuellt, sollte der Versuch wiederholt werden. Auf Grund der Stringenz der Methoden bedeuten niedrige Ergebnisse nicht unbedingt, daß die Prüfsubstanz unter Umweltbedingungen biologisch nicht abbaubar ist, sondern zeigt nur, daß weitere Untersuchungen erforderlich sind, um einen biologischen Abbau nachzuweisen.

Wenn in einem Toxizitätstest mit Prüf- und Referenzsubstanz innerhalb von 14 Tagen weniger als 35 % Abbau (auf DOC-Basis) bzw. weniger als 25 % (auf der Basis des ThSB oder ThCO2) erzielt wurde, kann von einer Hemmwirkung der Prüfsubstanz ausgegangen werden (vgl. auch Anhang IV). Die Versuchsreihe sollte in diesem Fall wiederholt werden, wenn möglich unter Verwendung einer geringeren Konzentration der Prüfsubstanz und/oder einer höheren Konzentration des Inokulums, jedoch nicht mehr als 30 mg Feststoffe pro Liter.

I.6. ALLGEMEINE VERFAHREN UND VORBEREITUNGEN

Die allgemeinen Prüfbedingungen sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Geräte und weitere Versuchsbedingungen speziell zu den Einzeltests werden gesondert in den entsprechenden Kapiteln zu den einzelnen Prüfverfahren angegeben.

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

I.6.1. Verdünnungswasser

Deionisiertes oder destilliertes Wasser, frei von toxischen Substanzen (z. B. Cu++-Ionen) in hemmenden Konzentrationen, wird verwendet. Es darf nicht mehr als 10 % des von der Prüfsubstanz eingebrachten organischen Kohlenstoffs enthalten. Die hohe Reinheit des Prüfwassers ist zur Vermeidung hoher Blindwerte erforderlich. Eine Kontamination kann sich aus inhärenten Verunreinigungen sowie aus dem Ionenaustauscherharz und Materialien aus Bakterien und Algen ergeben. Für jede Versuchsreihe ist nur eine Charge Wasser zu verwenden, die vorher durch DOC-Analyse zu prüfen ist. Diese Prüfung ist nicht nötig im Closed Bottle Test, aber der Sauerstoffverbrauch des Wassers muß gering sein.

I.6.2. Stammlösungen von mineralischen Bestandteilen

Zur Herstellung der Prüflösungen werden Stammlösungen mit geeigneten Konzentrationen an mineralischen Bestandteilen angesetzt. Für den DOC-Die Away Test, den Modifizierten ÖCD-Screening-Test, den CO2-Entwicklungstest, den Manometrischen Respirationstest und den Geschlossenen Flaschentest können folgende Stammlösungen (mit unterschiedlichen Verdünnungsfaktoren) verwendet werden.

Die Verdünnungsfaktoren und - beim MITI-Test - die spezielle Vorbereitung des mineralischen Mediums werden jeweils in den entsprechenden Kapiteln zu den einzelnen Versuchen angegeben.

Stammlösungen:

Die folgenden Stammlösungen sind unter Verwendung von Reagenzien des Reinheitsgrades "zur Analyse" (p. a.) anzusetzen:

(a) Kaliumdihydrogenorthophosphat, KH2PO48,50 g

Dikaliummonohydrogenorthophosphat, K2HPO421,75 g

Dinatriummonohydrogenorthophosphat Dihydrat, Na2HPO4 . 2 H2O33,40 g

Ammoniumchlorid, NH4Cl0,50 g in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefuellt; der pH-Wert der Lösung sollte 7,4 betragen.

(b) Calciumchlorid, wasserfrei, CaCl227,50 g

oder Calciumchlorid Dihydrat, CaCl2 . 2 H2O36,40 g in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefuellt

(c) Magnesiumsulfat Heptahydrat, MgSO4 . 7 H2O22,50 g in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefuellt

(d) Eisen(III)chlorid Hexahydrat, FeCl3 . 6 H2O0,25 g in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefuellt.

Anmerkung: Damit diese Lösung nicht unmittelbar vor Gebrauch zubereitet werden muß, ist ein Tropfen konz. HCl oder 0,4 g Dinatriumsalz der Ethylendiaminteträssigsäure (EDTA) pro Liter zuzufügen.

I.6.3. Stammlösungen der Chemikalien

Liegt die Löslichkeit über 1 g/l, sind je nach Notwendigkeit 1-10 g der Prüf- oder Referenzsubstanz in deionisiertem Wasser zu lösen und auf 1 l aufzufuellen. Ansonsten sind die Stammlösungen im mineralischen Medium anzusetzen oder die Prüfsubstanz wird direkt dem mineralischen Medium zugegeben. Die Vorgehensweise für schwerlösliche Substanzen ist in Anhang III angegeben; beim MITI-Test (Methode C.4-F) jedoch sind weder Lösungsmittel noch Emulgatoren zu verwenden.

I.6.4. Inokula

Das Inokulum kann aus verschiedenen Quellen gewonnen werden: aus Belebtschlamm, aus Kläranlagenablauf (nicht chloriert), aus Oberflächenwasser, aus Böden oder aus mehreren dieser Quellen zugleich. Bei den Methoden DOC-Die Away Test, CO2-Entwicklungs- test oder Manometrischer Respirationstest, sollte der Belebtschlamm, falls dieser verwendet wird, einer Klärgroß- oder -laboranlage entstammen, die hauptsächlich häusliche Abwässer reinigt. Bei Inokula aus anderen Quellen sind stärker streuende Ergebnisse festgestellt worden. Beim Modifizierten ÖCD-Screening-Test und beim Geschlossenen Flaschentest ist ein stärker verdünntes Inokulum ohne Schlammflocken erforderlich, vorzugsweise aus dem Ablauf einer kommunalen Kläranlage oder einer Laboranlage für häusliche Abwässer. Beim MITI-Test wird das Inokulum aus einer Kombination Verschiedener Quellen gewonnen - siehe Beschreibung im entsprechenden Kapitel.

I.6.4.1. Inokulum aus Belebtschlamm

Eine Belebtschlammprobe ist dem Belüftungstank einer Kläranlage oder einer Laboranlage, die hauptsächlich häusliche Abwässer reinigt, frisch zu entnehmen. Falls erforderlich, sind grobe Partikel durch Filtration durch ein feinmaschiges Sieb zu entfernen; danach ist der Schlamm ärob zu halten.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Schlamm nach Abtrennung grober Partikel absitzen zu lassen oder zu zentrifugieren (z. B. 10 min. bei 1 100 g). Der Überstand wird verworfen und der Schlamm kann im mineralischen Medium gewaschen werden. Der konzentrierte Schlamm wird in einem mineralischen Medium suspendiert, um eine Konzentration von 3-5 g suspendierte Feststoffe pro l zu erhalten. Anschließend wird bis zur Verwendung belüftet.

Der Schlamm sollte von einer gut arbeitenden konventionellen Anlage genommen werden. Wenn Schlamm aus einer Abwasserkläranlage verwendet werden muß, der vermutlich Substanzen mit hemmender Wirkung enthält, ist er zu waschen. Dazu lässt man den resuspendierten Schlamm nach gründlichem Durchmischen absitzen oder zentrifugiert ihn, verwirft anschließend den Überstand und suspendiert den gewaschenen Schlamm in einem weiteren Volumen mineralischen Mediums erneut. Diese Schritte sind solange zu wiederholen, bis der Schlamm als frei von übermässigem Substrat oder Hemmsubstanz angesehen wird.

Nach vollständiger Resuspension oder bei unbehandeltem Schlamm ist unmittelbar vor Gebrauch das Trockengewicht der suspendierten Feststoffe zu bestimmen.

Eine weitere Möglichkeit besteht in der Homogenisierung von Belebtschlamm (3-5 g suspendierte Feststoffe pro l). Dazu wird der Schlamm 2 min bei mittlerer Geschwindigkeit in einer mechanischen Mischvorrichtung durchmischt. Danach lässt man den durchmischten Schlamm 30 min, wenn erforderlich

länger, absitzen und dekantiert die als Inokulum verwendete Flüssigkeit mit einer Geschwindigkeit von 10 ml pro l mineralischen Mediums.

I.6.4.2. Andere Quellen für das Inokulum

Dieses lässt sich aus dem Ablauf einer Kläranlage oder einer Laboranlage für überwiegend häusliche Abwässer gewinnen. Dazu ist eine frische Probe zu entnehmen und während des Transports ärob zu halten. Zum Absetzen wird die Probe eine Stunde stehengelassen oder durch einen grobporigen Papierfilter filtriert und der dekantierte Ablauf (bzw. das Filtrat) bis zum Gebrauch ärob gehalten. Bis zu 100 ml diesen Inokulumtyps kann pro Liter Medium verwendet werden.

Als weitere Inokulumquelle dient Oberflächenwasser. In diesem Fall ist von einem geeigneten Oberflächenwasser (z. B. Fluß, See) eine Probe zu entnehmen und diese bis zum Gebrauch ärob zu halten. Falls erforderlich, wird das Inokulum durch Filtration oder Zentrifugieren konzentriert.

I.6.5. Vorbereitung der Inokula

Die Inokula können an die Versuchsbedingungen, nicht aber an die Prüfsubstanz adaptiert werden. Die entsprechende Konditionierung besteht in der Belüftung des Belebtschlamms im mineralischen Medium oder des Kläranlagenablaufs über eine Dauer von 5-7 Tagen bei der Prüftemperatur. Die Konditionierung verbessert mitunter die Präzision der Prüfmethoden durch eine Absenkung der Blindwerte. Eine Vorbereitung des MITI-Inokulums wird als nicht erforderlich angesehen.

I.6.6. Abiotische Kontrollen

Sofern erforderlich, sollte der mögliche abiotische Abbau der Prüfsubstanz durch Bestimmung der DOC-Abnahme, der Sauerstoffaufnahme oder der Kohlendioxidentwicklung in sterilen Kontrollen ohne Inokulum geprüft werden. Die Sterilisierung ist durch Membranfiltration (0,2-0,45 m) oder durch Hinzufügen von einer geeigneten toxischen Substanz in entsprechender Konzentration vorzunehmen. Wenn Membranfiltration verwendet wird, muß die Probenahme aseptisch erfolgen, um sterile Bedingungen zu wahren. Unter der Voraussetzung, daß die Adsorption der Prüfsubstanz nicht von vornherein ausgeschlossen werden kann, müssen Prüfungen auf der Grundlage der Messung von DOC-Abnahme, insbesondere bei Belebtschlamm-Inokula, eine abiotische Kontrolle, die beimpft und vergiftet wurde, beinhalten.

I.6.7. Anzahl der Flaschen

Die Anzahl der Flaschen in einem typischen Ansatz wird in den Kapiteln zu jedem Test beschrieben.

Die folgenden Flaschen sollten verwendet werden:

Prüfsuspension:enthält Prüfsubstanz und Inokulum

Inokulum-Blindwert:enthält nur Inokulum Verfahrenskontrolle:enthält Referenzsubstanz und Inokulum

Abiotische Sterilkontrolle:steril, enthält nur Prüfsubstanz (siehe I.6.6.)

Adsorptionskontrolle:enthält Prüfsubstanz, Inokulum und Sterilisierungsmittel

Toxizitätskontrolle:enthält Prüfsubstanz, Referenzsubstanz und Inokulum Die Bestimmung der Prüfsuspension und des Inokulum-Blindwerts muß unbedingt parallel durchgeführt werden. Die Bestimmungen der anderen Flaschen sollten ebenfalls parallel durchgeführt werden.

Dies ist eventuell nicht immer möglich. Es sollte sichergestellt sein, daß ausreichend Proben genommen oder Ablesungen vorgenommen werden, um die prozentuale Abnahme innerhalb des auszuwertenden "10-Tage-Fensters" zu beurteilen.

I.7. DATEN UND AUSWERTUNG

Zur Berechnung von Dt (prozentualer Abbau) werden die Mittelwerte der Wiederholungsmessung der Summenparameter in beiden Prüfgefässen und im Inokulum-Blindversuch verwendet. Die Formeln sind nachstehend in den jeweiligen Kapiteln angegeben. Der Verlauf des Abbaus wird graphisch dargestellt, und das 10-Tage-Fenster markiert. Die am Ende des 10-Tage-Fensters erreichte prozentuale Abnahme und der bei Erreichen des Plateaus bzw. bei Testende (je nach dem konkreten Fall) erzielte Wert sind zu berechnen und anzugeben.

In den respirometrischen Tests können stickstoffhaltige Substanzen den Sauerstoffverbrauch infolge Nitrifikation beeinträchtigen (vgl. Anhänge II und V).

I.7.1. Messung des Abbaus mittels DOC-Bestimmung

Der prozentuale Abbau (Dt) sollte für die Flaschen mit Prüfsubstanz zu jeder Probenahme-Zeit getrennt berechnet werden, wobei Mittelwerte der beiden DOC-Messungen verwendet werden, um die Validität der Prüfungen beurteilen zu können (siehe I.5.2.). Er wird wie folgt berechnet:

Dt = (1CtCbtCoCbo) 100

Hierin bedeuten:

Dt =prozentualer Abbau zum Zeitpunkt t,

Co =mittlere DOC-Anfangskonzentration im angeimpften Kulturmedium mit der Prüfsubstanz (mg DOC/l),

Ct =mittlere DOC-Konzentration im angeimpften Kulturmedium mit der Prüfsubstanz zum Zeitpunkt t (mg DOC/l),

Cbo =mittlere DOC-Anfangskonzentration des Blindwertes im angeimpften mineralischen Medium (mg DOC/l),

Cbt =mittlere DOC-Konzentration des Blindwertes im angeimpften mineralischen Medium zum Zeitpunkt t (mg DOC/l).

Sämtliche Konzentrationen werden experimentell bestimmt.

I.7.2. Messung des Abbaus mittels spezifischer Analytik

Liegen Daten aus einer spezifischen Analyse vor, ist der biologische Primärabbau wie folgt zu berechnen:

Dt = Sb SaSb 100

Hierin bedeuten:

Dt =prozentualer Abbau zum Zeitpunkt t, in der Regel nach 28 Tagen,

Sa =Restmenge an Prüfsubstanz im angeimpften Medium bei Versuchsende (mg),

Sb =Restmenge an Prüfsubstanz im Blindversuch mit Wasser/Medium, zu dem nur die Prüfsubstanz hinzugefügt wurde (mg).

I.7.3. Abiotischer Abbau

Bei abiotischer Sterilkontrolle wird der prozentuale abiotische Abbau wie folgt berechnet:

% abiotischer Abbau = Cs(o) Cs(t)Cs(o) 100

wobei:

Cs(o) =DOC Konzentration in Sterilkontrolle am Tag 0,

Cs(t) =DOC Konzentration in Sterilkontrolle am Tag t.

I.8. ABSCHLUSSBERICHT

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

- Prüf- und Referenzsubstanz und deren jeweiligen Reinheitsgrad;

- Versuchsbedingungen;

- Inokulum: Beschaffenheit und Herkunft, Konzentration und evtl. Vorbehandlung (Konditionierung);

- Anteil und Beschaffenheit der in den Abwässern enthaltenen Industrie-Abwässer (soweit bekannt);

- Versuchsdauer und -temperatur;

- bei schwerlöslichen Prüfsubstanzen: vorgenommene Behandlung;

- angewendetes Prüfverfahren; sämtliche Abweichungen hiervon sind wissenschaftlich zu begründen;

- Datenblatt;

- möglicherweise beobachtete Hemmwirkungen;

- ein möglicherweise beobachteter abiotischer Abbau;

- Daten aus spezifischer Analyse (falls vorhanden);

- Analysenwerte bezueglich Zwischenprodukte, wenn vorhanden;

- die Kurve des prozentualen Abbaus, aufgetragen gegen die Zeit, für Prüf- und Referenzsubstanz; die "lag"-Phase, die Abbauphase, das 10-Tage-Fenster und die Steigung sind klar anzugeben (Anhang I). Wenn der Test mit den Validitätskriterien übereinstimmt, sollte der Mittelwert der Abbauprozente der Flaschen mit Prüfsubstanz für die Auftragung verwendet werden;

- der prozentuale Abbau nach dem 10-Tage-Fenster sowie auf dem Plateau oder zu Versuchsende.

TEIL II: DOC - DIE AWAY TEST-ABNAHME VON GELÖSTEM ORGANISCHEM KOHLENSTOFF (DOC) (Methode C.4-A)

II.1. PRINZIP DER METHODE

Ein definiertes Volumen des angeimpften mineralischen Mediums mit einer bekannten Konzentration der Prüfsubstanz (10-40 mg DOC/l) als einziger nomineller Quelle organischen Kohlenstoffs wird im Dunkeln oder bei diffuser Beleuchtung bei 22 2 C belüftet.

Der Abbau wird mittels DOC-Analyse über einen Zeitraum von 28 Tagen in kurzen Zeitabständen verfolgt. Der Grad des biologischen Abbaus wird durch die Abnahme der DOC-Konzentration (nach Berücksichtigung des Inokulum-Blindwertes) in % der Ausgangskonzentration berechnet. Der Grad des biologischen Primärabbaus lässt sich aus der ergänzenden chemischen Analyse errechnen, die zu Beginn und am Ende der Inkubation vorgenommen wird.

II.2. BESCHREIBUNG DER METHODE

II.2.1. Geräte

(a) Konische Flaschen, z. B. 250 ml bis 2 l, je nach dem für die DOC-Analyse benötigten Volumen;

(b) Schüttelmaschine zur Aufnahme der konischen Flaschen, die entweder mit einem Thermostaten ausgestattet oder in einem klimatisierten Raum aufgestellt ist und so ausgelegt sein muß, daß ärobe Bedingungen in allen Flaschen aufrechterhalten werden;

(c) Filtrationsgerät mit geeigneten Membranen;

(d) DOC-Analysator;

(e) Gerät zur Bestimmung von gelöstem Sauerstoff;

(f) Zentrifuge.

II.2.2. Ansatz des mineralischen Mediums

Zubereitung der Stammlösung siehe I.6.2.

10 ml Lösung (a) mit 800 ml Verdünnungswasser mischen, 1 ml der Lösungen (b) bis (d) hinzugeben und mit Verdünnungswasser auf 1 l auffuellen.

II.2.3. Ansatz und Vorbereitung des Inokulums

Das Inokulum kann aus verschiedenen Quellen gewonnen werden: aus Belebtschlamm, aus Kläranlagenablauf, aus Oberflächenwasser, aus Böden oder aus mehreren dieser Quellen zugleich.

Vgl. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. und I.6.5.

II.2.4. Ansatz der Flaschen

Beispiel: Jeweils 800 ml des mineralischen Mediums werden in konische 2-l-Flaschen gegeben, dazu wird in jeweils separate Ansätzen ein ausreichendes Volumen Stammlösung der Prüf- und der Referenzsubstanz gegeben, um ein DOC-Äquivalent von 10-40 mg/l zu erhalten. Der pH-Wert sollte überprüft und wenn nötig auf 7,4 eingestellt werden. Die Flaschen werden mit Belebtschlamm oder einem Inokulum anderer Herkunft (vgl. I.6.4.) beimpft, um eine Endkonzentration nicht über 30 mg suspendierter Feststoffe pro Liter zu erhalten. Daneben werden Inokulum-Kontrollen im mineralischen Medium ohne Prüf- oder Referenzsubstanz angesetzt.

Falls erforderlich, ist ein Gefäß zur Kontrolle der möglichen Hemmwirkung der Prüfsubstanz zu verwenden; dazu ist eine Lösung mit vergleichbaren Konzentrationen sowohl der Prüf- als auch der Referenzsubstanz im mineralischen Medium anzuimpfen.

Falls erforderlich, ist eine weitere, sterile Flasche anzusetzen, um zu prüfen, ob die Prüfsubstanz abiotisch abgebaut wird; dazu ist eine nicht angeimpfte Lösung dieser Substanz zu verwenden (vgl. I.6,6.).

Wenn vermutet werden muß, daß die Prüfsubstanz signifikant am Glas oder am Schlamm usw. adsorbiert wird, ist eine Vorprüfung vorzunehmen, mit der das Ausmaß der Adsorption und damit die Eignung des Versuchs für die Prüfsubstanz bestimmt wird (vgl. Tabelle 1). Ansetzen einer Flasche mit Prüfsubstanz, Inokulum und Sterilisiermittel.

Alle Flaschen mit dem mineralischen Medium auf 1 l auffuellen, mischen, und anschließend von jeder Flasche eine Probe zwecks Bestimmung der DOC-Ausgangskonzentration entnehmen (vgl. Anhang II.4.). Öffnungen der Flaschen so abdecken, z. B. mit Aluminiumfolie, daß ein freier Luftaustausch zwischen der Flasche und der Umgebungsluft möglich bleibt. Danach die Flaschen in die Schüttelmaschine stellen und mit dem Versuch beginnen.

II.2.5. Anzahl der Flaschen in einem typischen Durchgang

Flaschen 1 und 2: Prüfsuspension

Flaschen 3 und 4: Inokulum-Blindwert

Flasche 5: Verfahrenskontrolle.

Empfohlen und falls notwendig:

Flasche 6: abiotische Sterilkontrolle

Flasche 7: Adsorptionskontrolle

Flasche 8: Toxizitätskontrolle

Vgl. I.6.7.

II.2.6. Durchführung der Prüfung

Während des Versuchs sind die DOC-Konzentrationen in jeder Flasche in bestimmten Zeitabständen doppelt zu bestimmen, und zwar so häufig, daß der Beginn des 10-Tage-Fensters und die prozentuale Abnahme am Ende des 10-Tage-Fensters bestimmt werden können. Dabei ist pro Messung nur die Mindestmenge an Prüfsuspension zu entnehmen.

Vor der Probeentnahme sind die Verdampfungsverluste aus den Flaschen, falls erforderlich, durch Zufügen von Verdünnungswasser auszugleichen (I.6.1.). Der Versuchsansatz ist vor Entnahme einer Probe gründlich zu durchmischen, wobei sicherzustellen ist, daß an den Wänden der Flaschen anhaftendes Material vor der Probenahme gelöst oder suspendiert wird. Unmittelbar nach der Probenahme ist zu filtrieren (Membranfilter) oder zu zentrifugieren (vgl. Anhang II.4). Die filtrierten oder zentrifugierten Proben sind noch am selben Tag zu analysieren; ansonsten können sie bei 2-4 C für maximal 48 h bzw. bei unter 18 C über einen längeren Zeitraum aufbewahrt werden.

II.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT

II.3.1. Auswertung der Ergebnisse

Der prozentuale Abbau zum Zeitpunkt t ist entsprechend I.7.1. (DOC-Bestimmung) sowie wahlweise entsprechend I.7.2. (spezifische Analyse) zu berechnen.

Sämtliche Ergebnisse sind auf den dafür vorgesehenen Datenblättern zu protokollieren.

II.3.2. Gültigkeit der Ergebnisse

Vgl. I.5.2.

II.3.3. Abschlußbericht

Vgl. I.8.

II.4. DATENBLATT

Nachstehend ein Beispiel eines Datenblattes.

DOC-DIE AWAY-TEST

1. LABOR

2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN

3. PRÜFSUSBSTANZ

Name:

Konzentration der Stammlösung: ... mg/l auf Substanz bezogen

Anfangskonzentration im Medium, t0: ... mg/l auf Substanz bezogen

4. INOKULUM

Herkunft: ...

Vorgenommene Behandlung: ...

Vorbereitung/Konditionierung (soweit zutreffend): ...

Konzentration der suspendierten Feststoffe im Reaktionsgemisch: ... mg/l

5. KOHLENSTOFFBESTIMMUNGEN

Kohlenstoffanalysator: ...

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

6. AUSWERTUNG DER ROHDATEN

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

7. ABIOTISCHE KONTROLLE (wahlweise)

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>% abiotischer Abbau = Cs(o) Cs(t)Cs(o) 100

8. SPEZIFISCHE ANALYSE (wahlweise)

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

TEIL III: MODIFIZIERTER ÖCD-SCREENING-TEST (Methode C.4-B)

III.1. PRINZIP DER METHODE

Ein definiertes Volumen des mineralischen Mediums mit einer bekannten Konzentration der Prüfsubstanz (10-40 mg/l DOC) als einziger nomineller Quelle organischen Kohlenstoffs wird mit 0,5 ml Kläranlagenablauf pro Liter Medium angeimpft und im Dunkeln oder bei diffuser Beleuchtung bei 22 2 C belüftet.

Der Abbau wird mittels DOC-Analyse über einen Zeitraum von 28 Tagen in kurzen Zeitabständen verfolgt. Der Grad des biologischen Abbaus wird durch die Abnahme der DOC-Konzentration (nach Berücksichtigung des Inokulum-Blindwertes) in % der Ausgangskonzentration berechnet. Der Grad des biologischen Primärabbaus lässt sich auch aus der ergänzenden chemischen Analyse errechnen, die zu Beginn und am Ende der Inkubation vorgenommen wird.

III.2. BESCHREIBUNG DER METHODE

III.2.1. Geräte

(a) Konische Flaschen, z. B. 250 ml bis 2 l, je nach dem für die DOC-Analyse benötigten Volumen;

(b) Schüttelmaschine zur Aufnahme der konischen Flaschen, die entweder mit einem Thermostaten ausgestattet oder in einem klimatisierten Raum aufgestellt ist und so ausgelegt sein muß, daß ärobe Bedingungen in allen Flaschen aufrechterhalten werden;

(c) Filtrationsgerät mit geeigneten Membranen;

(d) DOC-Analysator;

(e) Gerät zur Bestimmung von gelöstem Sauerstoff;

(f) Zentrifuge.

III.2.2. Ansatz des mineralischen Mediums

Zubereitung der Stammlösung siehe I.6.2.

10 ml Lösung (a) mit 800 ml Verdünnungswasser mischen, 1 ml der Lösungen (b) bis (d) hinzugeben und mit Verdünnungswasser auf 1 l auffuellen.

Bei diesem Verfahren werden nur 0,5 ml Kläranlagenablauf pro Liter als Inokulum verwendet, so daß das Medium möglicherweise mit Spurenelementen und Wachstumsfaktoren angereichert werden muß. Zu diesem Zweck werden von den folgenden Lösungen jeweils 1 ml pro Liter endgültigem Medium zugefügt.

Lösung der Spurenelemente:

Mangansulfat tetrahydrat, MnSO4 . 4H2O 39,9 mg

Borsäure, H3BO3 57,2 mg

Zinksulfat heptahydrat, ZnSO4 . 7H2O 42,8 mg

Ammoniumheptamolybdat, (NH4)6 Mo7O24 34,7 mg

Fe-Chelat (FeCl3 Ethylendiaminteträssigsäure) 100,0 mg

in Verdünnungswasser gelöst und auf 1 000 ml aufgefuellt.

Vitaminlösung:

Hefeextrakt15,0 mg

in 100 ml Wasser gelöst und durch Membranfilter mit 0,2 m Porengrösse steril filtriert bzw. frisch zubereitet.

III.2.3. Ansatz und Vorbereitung des Inokulums

Das Inokulum ist von Abläufen einer Kläranlage oder Anlage im Labormaßstab, denen vorwiegend häusliche Abwässer zugeführt werden, zu entnehmen. Vgl. I.6.4.2. und I.6.5.

0,5 ml pro Liter mineralisches Medium sind zu verwenden.

III.2.4. Ansatz der Flaschen

Beispiel: Jeweils 800 ml mineralischen Mediums werden in konische 2-l-Flaschen gegeben, dazu wird in jeweils separaten Ansätzen ein ausreichendes Volumen Stammlösung der Prüf- und der Referenzsubstanz gegeben, um ein DOC-Äquivalent von 10-40 mg/l zu erhalten. Der pH-Wert sollte überprüft und wenn nötig auf 7,4 eingestellt werden. Die Flaschen werden mit 0,5 ml Kläranlagenablauf pro Liter beimpft (vgl. I.6.4.2.). Daneben werden Inokulum-Kontrollen im mineralischen Medium ohne Prüf- oder Referenzsubstanz angesetzt.

Falls erforderlich, ist ein Gefäß zur Kontrolle der möglichen Hemmwirkung der Prüfsubstanz zu verwenden; dazu ist eine Lösung mit vergleichbaren Konzentrationen sowohl der Prüf- als auch der Referenzsubstanz im mineralischen Medium anzuimpfen.

Falls erforderlich, ist eine weitere, sterile Flasche anzusetzen, um zu prüfen, ob die Prüfsubstanz abiotisch abgebaut wird; dazu ist eine nicht angeimpfte Lösung dieser Substanz zu verwenden (vgl. I.6.6.).

Wenn vermutet werden muß, daß die Prüfsubstanz signifikant am Glas oder am Schlamm usw. adsorbiert wird, ist eine Vorprüfung vorzunehmen, mit der das Ausmaß der Adsorption und damit die Eignung des Versuchs für die Prüfsubstanz bestimmt werden (vgl. Tabelle 1). Ansetzen einer Flasche mit Prüfsubstanz, Inokulum und Sterilisiermittel.

Alle Flaschen mit dem mineralischen Medium auf 1 l auffuellen, mischen, und anschließend von jeder Flasche eine Probe zwecks Bestimmung der DOC-Ausgangskonzentration entnehmen (vgl. Anhang II.4.). Öffnungen der Flaschen so abdecken, z. B. mit Aluminiumfolie, daß ein freier Luftaustausch zwischen der Flasche und der Umgebungsluft möglich bleibt. Danach die Flaschen in die Schüttelmaschine stellen und mit dem Versuch beginnen.

III.2.5. Anzahl der Flaschen in einem typischen Durchgang

Flaschen 1 und 2: Prüfsuspension

Flaschen 3 und 4: Inokulum-Blindwert

Flasche 5: Verfahrenskontrolle Empfohlen und falls notwendig:

Flasche 6: abiotische Sterilkontrolle

Flasche 7: Adsorptionskontrolle

Flasche 8: Toxizitätskontrolle

Vgl. I.6.7.

III.2.6. Durchführung der Prüfung

Während des Versuchs sind die DOC-Konzentrationen in jeder Flasche in bestimmten Zeitabständen doppelt zu bestimmen, und zwar so häufig, daß der Beginn des 10-Tage-Fensters und die prozentuale Abnahme am Ende des 10-Tage-Fensters bestimmt werden können. Dabei ist pro Messung nur die Mindestmenge an Prüfsuspension zu entnehmen.

Vor der Probeentnahme sind die Verdampfungsverluste aus den Flaschen, falls erforderlich, durch Zufügen von Verdünnungswasser auszugleichen (I.6.1.). Der Versuchsansatz ist vor Entnahme einer Probe gründlich zu durchmischen, wobei sicherzustellen ist, daß an den Wänden der Flaschen anhaftendes Material vor der Probenahme gelöst oder suspendiert wird. Unmittelbar nach der Probenahme ist zu filtrieren (Membranfilter) oder zu zentrifugieren (vgl. Anhang II.4). Die filtrierten oder zentrifugierten Proben sind noch am selben Tag zu analysieren; ansonsten können sie bei 2-4 C für maximal 48 h bzw. bei unter 18 C über einen längeren Zeitraum aufbewahrt werden.

III.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT

III.3.1. Auswertung der Ergebnisse

Der prozentuale Abbau zum Zeitpunkt t ist entsprechend I.7.1. (DOC-Bestimmung) sowie wahlweise entsprechend I.7.2. (spezifische Analyse) zu berechnen.

Sämtliche Ergebnisse sind auf den dafür vorgesehenen Datenblättern zu protokollieren.

III.3.2. Gültigkeit der Ergebnisse

Vgl. I.5.2.

III.3.3. Prüfbericht

Vgl. I.8.

III.4. DATENBLATT

Nachstehend ein Beispiel eines Datenblattes.

MODIFIZIERTER ÖCD-SCREENING-TEST

1. LABOR

2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN

3. PRÜFSUSBSTANZ

Name:

Konzentration der Stammlösung: ... mg/l auf Substanz bezogen

Anfangskonzentration im Medium, t0: ... mg/l auf Substanz bezogen

4. INOKULUM

Herkunft: ...

Vorgenommene Behandlung: ...

Vorbereitung/Konditionierung (soweit zutreffend): ...

Konzentration der suspendierten Feststoffe im Reaktionsgemisch: ... mg/l

5. KOHLENSTOFFBESTIMMUNGEN

Kohlenstoffanalysator: ...

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

6. AUSWERTUNG DER ROHDATEN

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

7. ABIOTISCHE KONTROLLE (wahlweise)

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

% abiotischer Abbau = Cs(o) Cs(t)Cs(o) 100

8. SPEZIFISCHE ANALYSE (wahlweise)

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

TEIL IV: CO2-ENTWICKLUNGSTEST (Methode C.4-C)

IV.1. PRINZIP DER METHODE

Ein definiertes Volumen des angeimpften mineralischen Mediums mit einer bekannten Konzentration der Prüfsubstanz (10-20 mg DOC oder TOC/l) als einziger nomineller Quelle organischen Kohlenstoffs wird durch Einleiten von kohlendioxidfreier Luft bei gesteuerter Geschwindigkeit im Dunkeln oder bei diffusem Licht belüftet. Der Abbau wird über einen Zeitraum von 28 Tagen durch Bestimmung des erzeugten Kohlendioxids verfolgt, das in Bariumhydroxid oder Natronlauge gebunden und durch Titration des restlichen Hydroxids/der restlichen Lauge oder als anorganischer Kohlenstoff bestimmt wird. Die Menge des aus der Prüfsubstanz freigesetzten Kohlendioxids wird (nach Berücksichtigung der Menge aus dem Inokulum-Blindversuch) in % ThCO2 angegeben. Der Grad des biologischen Abbaus lässt sich auch aus der ergänzenden DOC-Analyse errechnen, die zu Beginn und am Ende der Inkubation vorgenommen wird.

IV.2. BESCHREIBUNG DER METHODE

IV.2.1. Geräte

a) Konische Flaschen, 2 bis 5 l, jeweils mit einem Belüftungsrohr, das nahezu auf den Boden der Flasche reicht, und mit einem Auslaß;

b) Magnetrührer (bei der Prüfung schwer löslicher Substanzen;

c) Gaswaschflaschen;

d) Einrichtung zur Steuerung und Messung des Luftstromes;

e) Gerät zur Kohlendioxidwäsche zwecks Gewinnung von Luft, die frei von Kohlendioxid ist; alternativ dazu kann ein Gemisch aus CO2-freiem Sauerstoff und CO2-freiem Stickstoff im richtigen Verhältnis aus Gasflaschen verwendet werden (20 % O2 : 80 % N2);

f) Einrichtung zur Kohlendioxidbestimmung, entweder durch Titration oder Analyse des anorganischen Kohlenstoffs;

g) Membranfiltrationsgerät (wahlweise),

h) DOC-Analysator (wahlweise).

IV.2.2. Ansatz des mineralischen Mediums

Zubereitung der Stammlösungen siehe I.6.2.

10 ml Lösung (a) mit 800 ml Verdünnungswasser mischen, 1 ml der Lösungen (b) bis (d) hinzugeben und mit Verdünnungswasser auf 1 l auffuellen.

IV.2.3. Ansatz und Vorbereitung des Inokulums

Das Inokulum kann aus verschiedenen Quellen gewonnen werden: aus Belebtschlamm, aus Kläranlagenablauf, aus Oberflächenwasser, aus Böden oder aus mehreren dieser Quellen zugleich.

Vgl. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. und I.6.5.

IV.2.4. Ansatz der Flaschen

Die folgenden Mengen- und Gewichtsangaben sind als Beispiel für 5-Liter-Flaschen mit 3 l Suspension zu verstehen. Werden Flaschen mit geringerem Volumen verwendet, sind die Angaben entsprechend zu ändern. Es muß allerdings sichergestellt sein, daß das gebildete Kohlendioxid exakt gemessen werden kann.

In jede 5-l-Flasche werden 2 400 ml mineralisches Medium gegeben. Dazu wird eine geeignete Menge des vorbereiteten Belebtschlamms hinzugefügt (vgl. I.6.4.1. und I.6.5.), um schließlich in den 3 l beimpfter Mischung eine Konzentration an suspendierten Feststoffen von nicht mehr als 30 mg/l zu erhalten. Alternativ dazu kann der vorbereitete Belebtschlamm zunächst im mineralischen Medium verdünnt werden zu einer Suspension von 500-1 000 mg/l. Danach wird dem Inhalt der 5-l-Flasche eine aliquote Menge hinzugegeben, um so eine Konzentration von 30 mg/l zu erhalten. Dieses letztere Verfahren sichert eine höhere Präzision. Es kann auch Inokulum anderer Herkunft verwendet werden (vgl. I.6.4.2.).

Diese angeimpften Mischungen sind über Nacht mit CO2-freier Luft zu belüften, um das System von Kohlendioxid zu reinigen.

Die Prüf- und die Referenzsubstanz sind getrennt als Stammlösungen bekannten Volumens in die Gefässe des Parallelansatzes zu geben, um so Substanzkonzentrationen von 10 bis 20 mg/l DOC oder TOC zu erhalten; einige Gefässe sind ohne Zugabe von Substanz als Inokulum-Kontrollen mitzuführen. Schwerlösliche Prüfsubstanzen sind auf Gewichts- oder Volumenbasis direkt in die Gefässe zu geben oder gemäß Anhang III zu behandeln.

Falls erforderlich, ist ein Gefäß zur Kontrolle der möglichen Hemmwirkung der Prüfsubstanz zu verwenden; dazu ist sowohl die Prüf- als auch die Referenzsubstanz in derselben Konzentration zuzugeben wie in den anderen Gefässen.

Falls erforderlich, ist eine weitere, sterile Flasche anzusetzen, um zu prüfen, ob die Prüfsubstanz abiotisch abgebaut wird; dazu ist eine nicht angeimpfte Lösung dieser Substanz zu verwenden (vgl. I.6.6.). Sterilisierung durch Zugabe einer toxischen Substanz in geeigneter Konzentration.

Die Suspensionen in allen Flaschen sind durch Zugabe des zuvor mit CO2-freier Luft belüfteten mineralischen Mediums aufzufuellen. Wahlweise können Proben zur DOC-Analyse (vgl. Anhang II.4.) und/oder zur spezifischen Analyse entnommen werden. Die Absorptionsflaschen sind mit den Gasauslässen der Flaschen zu verbinden.

Bei Verwendung von Bariumhydroxid sind an jede 5-l-Flasche drei Absorptionsflaschen, jeweils gefuellt mit 100 ml Bariumhydroxidlösung 0,0125 M, in Serie anzuschließen. Die Lösung muß frei von ausgefälltem Sulfat und Karbonat sein; die Konzentration der Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch zu bestimmen. Bei Verwendung von Natronlauge sind zwei Absorptionsfallen anzuschließen, wobei die zweite als Kontrolle dafür dient, ob das gesamte Kohlendioxid in der ersten Falle absorbiert wurde. Geeignet sind hierfür Absorptionsflaschen, die mit Serumflaschenverschlüssen versehen sind. In jede Flasche sind 200 ml Natronlauge 0,05 M zu geben; diese Menge ist ausreichend, um das gesamte bei vollständigem Abbau der Prüfsubstanz entstehende Kohlendioxid zu absorbieren. Auch nach frischer Zubereitung enthält die Natronlauge Spuren von Karbonaten, die durch Subtraktion des im Blindwert enthaltenen Karbonats berücksichtigt werden.

IV.2.5. Anzahl der Flaschen in einem typischen Durchgang

Flaschen 1 und 2: Prüfsuspension

Flaschen 3 und 4: Inokulum-Blindwert

Flasche 5: Verfahrenskontrolle.

Empfohlen und falls notwendig:

Flasche 6: abiotische Sterilkontrolle

Flasche 7: Toxizitätskontrolle

Vgl. auch I.6.7.

IV.2.6. Durchführung der Prüfung

Bei Versuchsbeginn wird CO2-freie Luft (Geschwindigkeit: 30-100 ml/min) in die Gefässe mit den Suspensionen geleitet. Zur Bestimmung der CO2-Entwicklung sind regelmässig Proben des Kohlendioxid-Absorbers zu entnehmen. Es wird empfohlen, diese Messungen in den ersten zehn Tagen alle zwei oder drei, danach bis zum 28. Tag alle fünf Tage vorzunehmen, um das 10-Tage-Fenster zu ermitteln.

Am 28. Tag werden Proben (wahlweise) zwecks DOC- und/oder spezifischer Analyse entnommen, der pH-Wert der Suspensionen gemessen und jeder Flasche 1 ml konzentrierte Salzsäure zugesetzt; die Flaschen sind über Nacht zu belüften, um das in den Prüfsuspensionen vorhandene Kohlendioxid auszutreiben. Am 29. Tag ist die letzte Bestimmung der Kohlendioxidentwicklung vorzunehmen.

An den Tagen, an denen CO2-Messungen vorgenommen werden, ist die dem Testgefäß am nächsten stehende Bariumhydroxid-Absorptionsflasche abzutrennen und die Hydroxidlösung mit HCl 0,05 M unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator zu titrieren. Die verbleibenden Absorptionsflaschen rücken jeweils um einen Platz auf, und eine neue Absorptionsflasche mit 100 ml frischem Bariumhydroxid 0,0125 M wird an das Ende der Serie hinzugefügt. Die Titrationen sind je nach Bedarf vorzunehmen, z. B. wenn in der ersten Falle deutliche Niederschläge auftreten, d. h. bevor ein Niederschlag in der zweiten Falle sichtbar wird, zumindest aber einmal pro Woche. Alternativ kann man - bei Verwendung von NaOH als Absorber - mit einer Spritze eine kleine Probe Natronlauge (je nach verwendetem Kohlenstoffanalysator) aus der dem Testgefäß am nächsten stehenden Absorptionsflasche entnehmen und diese zur Bestimmung der Kohlenstoffentwicklung direkt in den IC-Teil des Kohlenstoffanalysators einspritzen.

Der Inhalt der zweiten Absorptionsfalle ist nur am Versuchsende zu analysieren, um eine mögliche Kohlendioxidübertragung zu berücksichtigen.

IV.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT

IV.3.1. Auswertung der Ergebnisse

Die in einem Absorber gebundene Menge CO2 ergibt sich nach Titration:

mg CO2 = (100 CB 0,5 V CA) 44

Hierin bedeuten:

V = zur Titration der 100 ml im Absorber verbrauchtes Volumen HCl (ml),

CB = Konzentration der Bariumhydroxidlösung (M),

CA = Konzentration der Salzsäurelösung (M),

Wenn CB 0,0125 M und CA 0,05 M sind, beträgt das zur Titration von 100 ml Bariumhydroxid verbrauchte Volumen 50 ml, während sich die Menge an CO2 wie folgt ergibt:

0,052 44 ml titrierte HCl = 1,1 ml HCl

Der Faktor zur Umrechnung des titrierten HCl-Volumens in mg CO2 beträgt demnach 1,1.

Die Mengen des aus dem Inokulum allein und aus Inokulum plus Prüfsubstanz freigesetzten CO2 sind unter Verwendung der entsprechenden Titrationswerte zu berechnen; aus der Differenz ergibt sich die Menge des aus der Prüfsubstanz allein freigesetzten CO2.

Ergibt z. B. das Inokulum allein einen Titrationswert vom 48 ml, Inokulum plus Prüfsubstanz einen Wert von 45 ml, so betragen

CO2 aus dem Inokulum = 1,1 (50-48) = 2,2 mg

CO2 aus Inokulum plus Prüfsubstanz = 1,1 (50-45) = 5,5 mg,d.h. die Menge des aus der Prüfsubstanz allein freigesetzten CO2 liegt bei 3,3 mg.

Der prozentuale biologische Abbau berechnet sich wie folgt:

% Abbau = ThCO2 mg zugegebene Prüfsubstanzmg freigesetztes CO2 100

oder

% Abbau = mg im Versuch zugegebener TOC 3,67mg freigesetztes CO2 100

wobei 3,67 der Umrechnungsfaktor (44/12) von Kohlenstoff in Kohlendioxid ist.

Der prozentuale Abbau für jeden beliebigen Zeitabschnitt kann durch Addition der prozentualen ThCO2-Werte ermittelt werden, die für jeden einzelnen Tag bis zum Zeitpunkt der Messung berechnet worden sind.

Bei Verwendung von Adsorptionsgefässen mit Natronlauge ist die freigesetzte Kohlendioxidmenge, angegeben als IC (mg), durch Multiplikation der IC-Konzentration im Absorber mit dem Volumen des verwendeten Absorbers zu berechnen.

Der prozentuale biologische Abbau berechnet sich wie folgt:

% ThCO2 = mg IC aus dem Prüfgefäß mg IC des Blindwertesmg als Prüfsubstanz hinzugefügter TOC 100

Die DOC-Abnahme wird (wahlweise) entsprechend den Angaben unter Punkt 1.7. berechnet. Die erhaltenen Werte werden zusammen mit allen anderen Ergebnissen auf den vorliegenden Datenblättern protokolliert.

IV.3.2. Validität der Ergebnisse

Der IC-Gehalt der Prüfsuspension im mineralischen Medium zu Versuchsbeginn darf nicht mehr als 5 % des TC-Wertes betragen, und die gesamte CO2-Entwicklung des Inokulum-Blindwertes zu Versuchsende sollte normalerweise 40 mg/l Medium nicht überschreiten. Bei Werten über 70 mg CO2 pro Liter sollten die Daten und das Versuchsverfahren kritisch überprüft werden.

Vgl. auch I.5.2.

IV.3.3. Abschlußbericht

Vgl. I.8.

IV.4. DATENBLATT

Nachstehend ein Beispiel eines Datenblattes.

KOHLENDIOXIDENTWICKLUNGSTEST

1. LABOR

2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN

3. PRÜFSUBSTANZ

Name:

Konzentration der Stammlösung: ... mg/l auf Substanz bezogen

Anfangskonzentration im Medium: ... mg/l auf Substanz bezogen

In die Flasche gegebene Gesamtmenge an C (TC): ... mg C ThCO2: ... mg CO2

4. INOKULUM

Herkunft: ...

Vorgenommene Behandlung: ...

Vorbereitung/Konditionierung (soweit zutreffend): ...

Konzentration der suspendierten Feststoffe im Reaktionsgemisch: ... mg/l

5. KOHLENDIOXIDENTWICKLUNG UND ABBAUBARKEIT

Methode: Ba(OH)2/NaOH/Sonstige ...

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

6. KOHLENSTOFFANALYSE (wahlweise)

Kohlenstoffanalysator: ...

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

% DOC-Abnahme = 1 Ct Cb(t) CoCb(o) 100

7. ABIOTISCHER ABBAU (wahlweise)

% abiotischer Abbau = CO2-Bildung Sterilkontrolle nach 28 Tagen (mg)ThCO2 (mg) 100

TEIL V: MANOMETRISCHER RESPIRATIONSTEST (Methode C.4-D)

V.1. PRINZIP DER METHODE

Ein definiertes Volumen des angeimpften mineralischen Mediums mit einer bekannten Konzentration der Prüfsubstanz (100 mg/l), die einem ThSB von mindestens 50-100 mg/l entsprechen als einziger nomineller Quelle organischen Kohlenstoffs, wird in einer geschlossenen Flasche bei konstanter Temperatur ( 1 C oder genauer) bis zu 28 Tage gerührt. Der Sauerstoffverbrauch wird entweder durch Messung der (elektrolytisch erzeugten) Sauerstoffmenge bestimmt, die erforderlich ist, um in der Respirometerflasche ein konstantes Gasvolumen aufrechtzuerhalten, oder aus der Änderung des Volumens oder Drucks im Gerät (bzw. einer Kombination beider Parameter). Das entstandene Kohlendioxid wird in einer Lösung von Kaliumhydroxid oder einem anderen geeigneten Absorptionsmittel absorbiert. Die Menge des von der Prüfsubstanz aufgenommenen Sauerstoffs wird (nach Berücksichtigung des entsprechenden Wertes in dem parallel mitgeführten Inokulum-Blindversuchs) als prozentualer Anteil des ThSB oder CSB angegeben. Wahlweise, lässt sich Totalabbau durch DOC-Analyse, primärer biologischer Abbau auch aus einer ergänzenden spezifischen Analyse errechnen, die zu Beginn und am Ende der Inkubation vorgenommen wird.

V.2. BESCHREIBUNG DER METHODE

V.2.1. Geräte

(a) geeignetes Respirationsmeßgerät;

(b) Thermostat mit einer Temperaturkonstanz von 1 C oder genauer;

(c) Membranfiltrationsgerät (wahlweise);

(d) Kohlenstoffanalysator (wahlweise).

V.2.2. Ansatz des mineralischen Mediums

Zubereitung der Stammlösungen siehe I.6.2.

10 ml Lösung (a) mit 800 ml Verdünnungswasser mischen, 1 ml der Lösungen (b) bis (d) hinzugeben und mit Verdünnungswasser auf 1 l auffuellen.

V.2.3. Ansatz und Vorbereitung des Inokulums

Das Inokulum kann aus verschiedenen Quellen gewonnen werden: aus Belebtschlamm, aus Kläranlagenablauf, aus Oberflächenwasser, aus Böden oder aus mehreren dieser Quellen zugleich.

Vgl. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. und I.6.5.

V.2.4. Ansatz der Flaschen

Lösungen der Prüf- und Referenzsubstanz sind aus den Stammlösungen in getrennten Ansätzen in einer Konzentration von normalerweise 100 mg/l Substanz entsprechend einem ThSB von mindestens 50-100 mg/l zuzubereiten.

Der ThSB ist auf der Grundlage der Bildung von Ammoniumsalzen zu berechnen, sofern nicht eine Nitrifikation zu erwarten ist, bei der die Berechnung auf der Grundlage einer Nitratbildung vorzunehmen ist (siehe Anhang II.2.).

Die pH-Werte sind zu bestimmen und, falls erforderlich, auf 7,4 0,2 einzustellen.

Schwerlösliche Substanzen sollten zu einem späteren Zeitpunkt hinzuzugeben werden (siehe unten).

Wenn die Toxizität der Prüfsubstanz bestimmt werden soll, ist eine weitere Lösung in mineralischem Medium anzusetzen, die sowohl die Prüf- als auch die Referenzsubstanz enthält, und zwar in denselben Konzentrationen wie bei den Einzelansätzen.

Soweit die Messung der physikalisch-chemischen Sauerstoffaufnahme erforderlich ist, ist eine durch Zugabe einer geeigneten toxischen Substanz sterilisierte Lösung mit der Prüfsubstanz, entsprechend einem ThSB von normalerweise 100 mg/l, anzusetzen (vgl. I.6,6.).

Die erforderliche Menge der Lösungen der Prüf- und der Referenzsubstanz wird jeweils auf zwei Flaschen verteilt. Daneben sind weitere Flaschen nur mit dem mineralischen Medium (für die Inokulum-Kontrollen) und, falls erforderlich, mit der gemischten Prüf-/Referenzlösung und mit der sterilen Lösung anzusetzen.

Handelt es sich um eine schwerlösliche Prüfsubstanz, wird diese gewichts- oder volumenbezogen zu diesem Zeitpunkt direkt in die Gefässe gegeben oder nach Anhang III behandelt. In die CO2-Absorptionsflaschen sind Kaliumhydroxid, Natronkalk-Pellets oder ein anderes Absorptionsmittel zu geben.

V.2.5. Anzahl der Flaschen in einem typischen Durchgang

Flaschen 1 und 2: Prüfsuspension

Flaschen 3 und 4: Inokulum-Blindwert

Flasche 5: Verfahrenskontrolle.

Empfohlen und falls notwendig:

Flasche 6: Sterilkontrolle

Flasche 7: Toxizitätskontrolle

Vgl. I.6.7.

V.2.6. Durchführung der Prüfung

Nachdem die Gefässe die gewünschte Temperatur erreicht haben, werden sie mit vorbereitetem Belebtschlamm oder einem Inokulum anderer Herkunft in einer Konzentration von nicht mehr als 30 mg suspendierter Feststoffe pro Liter beimpft. Danach wird die Versuchsanordnung zusammengestellt, das Rührgerät angestellt, auf Luftabschluß geprüft und mit der Messung der Sauerstoffaufnahme begonnen. Bis auf die notwendigen Ablesungen sowie täglichen Kontrollen der richtigen Temperatur und des erforderlichen angemessenen Rührens ist gewöhnlich kein weiterer Aufwand notwendig.

Die Sauerstoffaufnahme ist aus den in regelmässigen und kurzen Abständen abgelesenen Meßwerten zu berechnen; dabei sind die vom Gerätehersteller angegebenen Methoden zu verwenden. Am Ende der Inkubation, normalerweise nach 28 Tagen, sind die pH-Werte der Flascheninhalte zu messen, insbesondere wenn die Sauerstoffaufnahme niedrig ist bzw. über dem ThSBNH4 liegt (für stickstoffhaltige Verbindungen).

Falls erforderlich, sind den Respirometerflaschen am Anfang und am Ende Proben zur DOC-Analyse oder zur spezifischen Analyse zu entnehmen (vgl. Anhang II.4.). Bei der ersten Probenahme ist sicherzustellen, daß das Volumen der in der Flasche verbleibenden Prüfsuspension bekannt ist. Im Falle der Sauerstoffaufnahme einer stickstoffhaltigen Prüfsubstanz, ist die Zunahme der Nitrit- und Nitratkonzentration über einen Zeitraum von 28 Tagen zu bestimmen und der Sauerstoffverbrauch infolge Nitrifikation zu berücksichtigen (Anhang V).

V.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT

V.3.1. Auswertung der Ergebnisse

Die Sauerstoffaufnahme (mg) der Prüfsubstanz nach einer vorgegebenen Zeit (korrigiert um die Sauerstoffaufnahme der Inokulum-Blindkontrolle nach der gleichen Zeit) ist durch das Gewicht der verwendeten Prüfsubstanz zu dividieren. Dadurch erhält man den BSB, ausgedrückt als mg Sauerstoff pro mg Prüfsubstanz:

BSB = mg O2-Aufn. der Prüfsubst. mg O2-Aufn. der Blindkontr.mg Prüfsubst. in der Flasche = mg O2 pro mg Prüfsubstanz

Der prozentuale biologische Abbau ist zu berechnen entweder nach:

% biolog. Abbau = % ThSB = BSB (mg O2/mg Substanz)ThSB (mgO2/mg Substanz) 100,

oder nach:

% CSB = BSB (mg O2/mg Substanz) CSB (mg O2/mg Substanz) 100

Dabei ist anzumerken, daß diese beiden Verfahren nicht notwendigerweise denselben Wert ergeben; vorzugsweise sollte das erstere Verfahren angewendet werden.

Bei stickstoffhaltigen Prüfsubstanzen ist, je nachdem ob eine Nitrifikation zu erwarten ist oder nicht, der entsprechende ThSB-Wert (NH4 oder NO3) zu verwenden (Anhang II.2). Bei auftretender, jedoch unvollständiger Nitrifikation, ist aus den Veränderungen der Nitrit- und Nitratkonzentration ein Korrekturfaktor für den durch die Nitrifikation verbrauchten Sauerstoff zu berechnen (Anhang V).

Wenn wahlweise Bestimmungen des organischen Kohlenstoffs und/oder einer Einzelsubstanz vorgenommen werden, ist der prozentuale Abbau entsprechend I.7. zu berechnen.

Sämtliche Ergebnisse sind auf den beigefügten Datenblättern zu protokollieren.

V.3.2. Gültigkeit der Ergebnisse

Die Sauerstoffaufnahme des Inokulum-Blindwertes liegt normalerweise bei 20-30 mg/l O2 und sollte nach 28 Tagen nicht grösser sein als 60 mg/l. Bei Werten über 60 mg/l sollten die Daten und Versuchsdurchführung kritisch überprüft werden. Wenn der pH-Wert ausserhalb des Bereichs 6-8,5 liegt und der Sauerstoffverbrauch durch die Prüfsubstanz unter 60 % beträgt, ist der Test mit einer geringeren Konzentration der Prüfsubstanz zu wiederholen.

Vgl. auch I.5.2.

V.3.3. Abschlußbericht

Vgl. I.8.

V.4. DATENBLATT

Nachstehend ein Beispiel eines Datenblattes.

MANOMETRISCHER RESPIRATIONSTEST

1. LABOR

2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN

3. PRÜFSUBSTANZ

Name:

Konzentration der Stammlösung: ... mg/l

Anfangskonzentration im Medium, Co: ... mg/l

Volumen in der Prüfflasche (V): ... ml

ThSB/CSB: ... mg O2/mg Prüfsubstanz (NH4, NO3)

4. INOKULUM

Herkunft: ...

Vorgenommene Behandlung: ...

Vorbereitung/Konditionierung (soweit zutreffend): ...

Konzentration der suspendierten Feststoffe im Reaktionsgemisch: ... mg/l

5. SAUERSTOFFAUFNAHME: BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

6. KORREKTUR INFOLGE NITRIFIKATION (vgl. Anhang V)

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

7. KOHLENSTOFFANALYSE (wahlweise)

Kohlenstoffanalysator: ...

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

% DOC-Abnahme = 1 Ct Cblt Co Cblo 100

8. SPEZIFISCHE ANALYSE (wahlweise)

Sb = Konzentration der Prüfsubstanz in der physikalisch-chemischen (steril-) Kontrolle nach 28 Tagen

Sa = Konzentration in der angeimpften Flasche nach 28 Tagen

% biologischer Primärabbau = Sb SaSb 100

9. ABIOTISCHER ABBAU (wahlweise)

a = Sauerstoffverbrauch in sterilen Flaschen nach 28 Tagen (mg)

Sauerstoffverbrauch pro mg Prüfsubstanz = CoVa

(vgl. Abschnitte 1 und 3)

% abiotischer Abbau = CoV ThSBa 100

TEIL VI: GESCHLOSSENER FLASCHENTEST (Methode C.4-E)

VI.1. PRINZIP DER METHODE

Die Lösung der Prüfsubstanz im mineralischen Medium, normalerweise in einer Konzentration von 2-5 mg/l, wird mit einer relativ kleinen Anzahl Mikroorganismen einer gemischten Population beimpft und in vollständig gefuellten, verschlossenen Flaschen im Dunkeln bei konstanter Temperatur gehalten. Der Abbau wird 28 Tage lang mittels Analyse des gelösten Sauerstoffs verfolgt. Die von der Prüfsubstanz verbrauchte Sauerstoffmenge, korrigiert um die Aufnahme im parallelen Inokulum-Blindversuch, wird als Prozent des ThSB oder CSB angegeben.

VI.2. BESCHREIBUNG DER METHODE

VI.2.1. Geräte

a) BSB-Flaschen mit Glasstopfen, z. B. 250-300 ml;

b) Wasserbad oder Inkubator, in dem die Flaschen im Dunkeln bei konstanter Temperatur ( 1 C oder genauer) gehalten werden;

c) Grosse Glasflaschen (2-5 l) zur Vorbereitung der Medien und zum Füllen der BSB-Flaschen;

d) Sauerstoffelektrode und -meßgerät bzw. Ausrüstung und Reagenzien zur Winkler-Titration.

VI.2.2. Ansatz des mineralischen Mediums

Zubereitung der Stammlösungen siehe I.6.2.

1 ml der Lösungen (a) bis (d) zusammengeben und mit Verdünnungswasser auf 1 l auffuellen.

VI.2.3. Ansatz des Inokulums

Das Inokulum ist normalerweise von Abläufen einer Kläranlage oder Anlagen im Labormaßstab, denen vorwiegend häusliche Abwässer zugeleitet werden, zu entnehmen. Alternativ kann ein Inokulum aus Oberflächengewässern verwendet werden. Die Verwendung sollte üblicherweise ein Tropfen (0,05 ml) bis 5 ml Filtrat pro Liter Medium betragen; Versuche können erforderlich werden, um das geeignete Volumen für den jeweiligen Ablauf zu ermitteln. (Vgl. I.6.4.2. und I.6.5.).

VI.2.4. Ansatz der Flaschen

Das mineralische Medium ist über mindestens 20 min intensiv zu belüften. Jede Prüfreihe ist mit mineralischem Medium aus derselben Charge durchzuführen. Im allgemeinen ist das Medium nach 20 h-Stehen bei der Prüftemperatur gebrauchsfertig. Für Kontrollzwecke ist die Konzentration des gelösten Sauerstoffs zu bestimmen; der Wert sollte bei 20 C etwa 9 mg/l betragen. Alle Transfer- und Fülloperationen mit luftgesättigtem Medium sind blasenfrei auszuführen, z. B. durch Verwendung von Ansaughebern.

Gruppen von Flaschen zur gleichzeitigen BSB-Bestimmung der Prüf- und Referenzsubstanz werden in parallelen Versuchsreihen angesetzt. Eine ausreichende Anzahl von BSB-Flaschen - einschließlich der für die Inokulum-Blindversuche - ist so aufzustellen, daß zu den gewünschten Zeitpunkten, z. B. nach 0, 7, 14, 21 und 28 Tagen, mindestens Doppelmessungen des Sauerstoffverbrauchs vorgenommen werden können. Wenn das 10-Tage-Fenster erkannt werden soll, können mehr Flaschen erforderlich sein.

Die grossen Flaschen werden zu etwa einem Drittel ihres Volumens mit vollständig belüftetem mineralischem Medium gefuellt. Danach wird soviel an Stammlösungen der Prüf- sowie der Referenzsubstanz in getrennte Flaschen gegeben, daß die Endkonzentration der Substanzen im Normalfall nicht grösser als 10 mg/l ist. Der Blindkontrolle werden in einer anderen grossen Flasche keine chemischen Substanzen hinzugesetzt.

Um sicherzustellen, daß die Aktivität des Inokulums nicht eingeschränkt wird, darf die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in den BSB-Flaschen nicht unter 0,5 mg/l fallen. Dies beschränkt die Konzentration der Prüfsubstanz auf etwa 2 mg/l. Für schwer abbaubare Substanzen und solche mit einem geringen ThSB können jedoch 5-10 mg/l verwendet werden. In einigen Fällen kann es ratsam sein, parallele Versuchsreihen mit der Prüfsubstanz in zwei verschiedenen Konzentrationen, z. B. 2 und 5 mg/l, anzusetzen. Normalerweise ist der ThSB auf der Grundlage der Bildung von Ammoniumsalzen zu berechnen; wenn aber eine Nitrifikation erwartet oder vorausgesetzt werden kann, muß die Berechnung auf der Basis der Nitratbildung erfolgen (ThSBNO3: siehe Anhang II.2.). Bei auftretender, jedoch unvollständiger Nitrifikation, muß eine Korrektur erfolgen, die die Veränderungen der analytisch ermittelten Nitrit- und Nitratkonzentration berücksichtigt (Anhang V).

Wenn die Toxizität der Prüfsubstanz bestimmt werden soll (z. B. im Falle einer zuvor ermittelten geringen biologischen Abbaubarkeit), ist eine zusätzliche Reihe Flaschen notwendig.

Eine weitere grosse Flasche ist mit belüftetem mineralischem Medium (etwa bis zu einem Drittel ihres Volumens) mit Prüf- und Referenzsubstanz zusammen anzusetzen, in Endkonzentrationen wie normalerweise in den anderen grossen Flaschen.

Die Lösungen in den grossen Flaschen sind mit dem Ablauf aus einer Kläranlage (ein Tropfen oder etwa 0,05 ml auf 5 ml/l) oder mit einem Inokulum anderer Herkunft, z. B. Flußwasser, zu beimpfen (vgl. I.6.4.2.). Schließlich werden die Lösungen mit Hilfe eines Schlauches, der bis zum Boden der Flasche reicht, mit belüftetem mineralischem Medium aufgefuellt, um eine ausreichende Durchmischung zu gewährleisten.

VI.2.5. Anzahl der Flaschen in einem typischen Ansatz

In einem typischen Ansatz werden folgende Flaschen benötigt:

mindestens 10 Flaschen mit Prüfsubstanz und Inokulum (Prüfsuspension),

mindestens 10 Flaschen nur mit Inokulum (Inokulum-Blindwert),

mindestens 10 Flaschen mit Referenzsubstanz und Inokulum (Verfahrenskontrolle),

sowie, falls erforderlich, 6 Flaschen mit der Prüf-, der Referenzsubstanz und dem Inokulum (Toxizitätskontrolle). Um jedoch sicherzustellen, das 10-Tage-Fenster zu erkennen, ist etwa die doppelte Anzahl Flaschen erforderlich.

VI.2.6. Durchführung der Prüfung

Jede zubereitete Lösung wird sofort mit einem Schlauch aus dem unteren Viertel (nicht vom Flaschenboden) der entsprechenden grossen Flasche auf die jeweilige Gruppe von BSB-Flaschen verteilt, bis alle BSB-Flaschen vollständig gefuellt sind. Danach wird leicht an die Flaschen geklopft, um mögliche Luftblasen zu entfernen. Die Flaschen zum Zeitpunkt 0 werden sofort nach dem Winkler- oder dem Elektrodenverfahren auf gelösten Sauerstoff analysiert. Der Inhalt der Flaschen kann zwecks späterer Analyse durch Zugabe von Mangan-(II)-sulfat und Natronlauge (dem ersten Winkler-Reagens) konserviert werden. Die sorgfältig mit einem Stopfen verschlossenen Flaschen, die den fixierten Sauerstoff als braunes Mangan-(III)1oxihydrat enthalten, sind im Dunkeln bei 10-20 C nicht länger als 24 h aufzubewahren, bevor mit dem Winkler-Verfahren fortgefahren wird. Die verbleibenden parallelen Flaschen werden mit einem Stopfen versehen, wobei darauf zu achten ist, daß keine Luftblasen in den Flaschen eingeschlossen werden, und bei 20 C im Dunkeln inkubiert. Neben jeder Versuchsreihe führt man eine vollständige Parallelreihe zur Bestimmung des Inokulum-Blindwertes mit. Während der 28-tägigen Inkubation sind in bestimmten Zeitabständen (mindestens einmal wöchentlich) mindestens zwei Flaschen pro Serie zwecks Untersuchung auf gelösten Sauerstoff zu entnehmen.

Die wöchentlichen Proben gestatten die Bewertung der prozentualen Abnahme in einem 14-Tage-Fenster, während die Probenahme alle 3-4 Tage die Bestimmung des 10-Tage-Fensters ermöglichen soll, wofür jedoch etwa die doppelte Anzahl von Flaschen erforderlich ist.

Bei stickstoffhaltigen Prüfsubstanzen sind Korrekturen für die Sauerstoffaufnahme infolge Nitrifikation vorzunehmen. Dazu ist die O2-Elektrodenmethode zur Bestimmung der Konzentration von gelöstem Sauerstoff zu verwenden und anschließend zwecks Nitrit- und Nitratanalyse eine Probe aus der BSB-Flasche zu entnehmen. Aus der Zunahme der Nitrit- und Nitratkonzentration ist der Sauerstoffverbrauch zu berechnen (siehe Anhang V).

VI.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT

VI.3.1. Auswertung der Ergebnisse

Zuerst ist der BSB nach jedem Zeitabschnitt zu berechnen; dazu ist die O2-Eigenzehrung (mg O2/l) des Inokulum-Blindansatzes von dem Wert des Prüfansatzes zu subtrahieren. Diese korrigierte Zehrung ist durch die Konzentration (mg/l) der Prüfsubstanz zu dividieren, um so den spezifischen BSB, ausgedrückt als mg Sauerstoff pro mg Prüfsubstanz, zu erhalten. Die prozentuale biologische Abbaubarkeit wird dann durch Dividieren des spezifischen BSB durch den spezifischen ThSB (bestimmt entsprechend Anhang II.2) oder CSB (bestimmt durch Analyse, vgl. Anhang II.3) wie folgt berechnet:

BSB = mg O2-Aufn. der Prüfsubst. mg O2-Aufn. der Blindkontr.mg Prüfsubst. in der Flasche = mg O2 pro mg Prüfsubstanz

= mg O2 pro mg Prüfsubstanz

% Abbau = BSB (mg O2/mg Prüfsubstanz) ThSB (mg O2/mg Prüfsubstanz) 100

oder

% Abbau = BSB (mg O2/mg Prüfsubstanz) CSB (mg O2/mg Prüfsubstanz) 100

Dabei ist anzumerken, daß diese beiden Verfahren nicht notwendigerweise denselben Wert ergeben; vorzugsweise sollte das erste Verfahren verwendet werden.

Bei stickstoffhaltigen Prüfsubstanzen ist, je nachdem ob eine Nitrifikation zu erwarten ist oder nicht (Anhang II.2), der entsprechende ThSB-Wert (NH4 oder NO3) zu verwenden. Bei stattfindender, jedoch unvollständiger Nitrifikation, ist aus den Veränderungen der Nitrit- und Nitratkonzentration ein Korrekturfaktor für den durch die Nitrifikation verbrauchten Sauerstoff zu berechnen (Anhang V).

VI.3.2. Gültigkeit der Ergebnisse

Bei der Impfzehrkontrolle sollte der Sauerstoffverbrauch nach 28 Tagen 1,5 mg gelösten Sauerstoff pro Liter nicht überschreiten. Bei höheren Werten ist eine Überprüfung der Versuchsdurchführung vorzunehmen. Die in den Prüfflaschen verbleibende Sauerstoffkonzentration darf zu keinem Zeitpunkt 0,5 mg/l unterschreiten. Solch niedrige Sauerstoffkonzentrationen sind nur gültig, wenn das zur Bestimmung des gelösten Sauerstoffs verwendete Verfahren in der Lage ist, solche Konzentrationen genau zu messen.

Vgl. auch I.5.2.

VI.3.3. Abschlußbericht

Vgl. I.8.

VI.4. DATENBLATT

Nachstehend ein Beispiel eines Datenblattes

GESCHLOSSENER FLASCHENTEST

1. LABOR

2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN

3. PRÜFSUBSTANZ

Name:

Konzentration der Stammlösung: ... mg/l

Anfangskonzentration in der Flasche: ... mg/l

ThSB bzw. CSB: ... mg O2/mg Prüfsubstanz

4. INOKULUM

Herkunft: ...

Vorgenommene Behandlung: ...

Vorbereitung/Konditionierung (falls zutreffend): ...

Konzentration im Reaktionsgemisch: ... ml/l

5. DO-BESTIMMUNG

Methode: Winkler- oder Elektrodenverfahren

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

6. KORREKTUR INFOLGE NITRIFIKATION (vgl. Anhang V)

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

7. DO-ZEHRUNG: % ABBAU

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

mto = Wert in der Prüfflasche zur Zeit 0

mtx = Wert in der Prüfflasche zur Zeit x

mbo = Mittelwert Blindansatz zur Zeit 0

mbx = Mittelwert Blindansatz zur Zeit x

Ausserdem ist die Korrektur infolge Nitrifikation aus iii+iv in Abschnitt 6 vorzunehmen.

8. DO-ZEHRUNG IM INOKULUM-BLINDANSATZ

Sauerstoffverbrauch im Blindversuch: (mbo mb28) mg/l. Dieser Verbrauch ist wichtig für die Gültigkeit des Tests. Er sollte unter 1,5 mg/l liegen.

TEIL VII: MITI-TEST (Methode C.4-F)

VII.1. Prinzip der Methode

Das Prinzip der Methode besteht in der automatischen Messung der Sauerstoffaufnahme durch eine gerührte Lösung oder Suspension der Prüfsubstanz in einem mit speziell gezuechteten, nicht adaptierten Mikroorganismen angeimpften mineralischen Medium; die Messung erfolgt über einen Zeitraum von 28 Tagen in einem abgedunkelten, geschlossenen Respirationsmeßgerät bei 25 1 C. Das entstehende Kohlendioxid wird durch Natronkalk absorbiert. Die biologische Abbaubarkeit wird als prozentuale Sauerstoffaufnahme (nach Berücksichtigung der Aufnahme aus dem Blindansatz) auf der Grundlage der theoretischen Aufnahme (ThSB) angegeben. Zusätzlich wird der Grad des biologischen Primärabbaus aus der ergänzenden spezifischen Analyse errechnet, die zu Beginn und am Ende der Inkubation vorgenommen wird, wahlweise auch durch DOC-Analyse.

VII.2. BESCHREIBUNG DER METHODE

VII.2.1. Geräte

a) Automatisches elektrolytisches BSB-Meßgerät oder Respirometer, normalerweise ausgestattet mit 6 Flaschen zu je 300 ml mit Bechern für das CO2-Absorbens;

b) Klimakammer und/oder Wasserbad mit 25 C 1 C oder genauer;

c) Membranfiltrationsgerät (wahlweise)

d) Kohlenstoffanalysator (wahlweise).

VII.2.2. Ansatz des mineralischen Mediums

Die folgenden Stammlösungen sind unter Verwendung von Reagenzien des Reinheitsgrades zur Analyse (p. a.) und Wasser (I.6.1.) anzusetzen:

(a) Kaliumdihydrogenorthophosphat, KH2PO4 8,50 g

Dikaliummonohydrogenorthophosphat, K2HPO4 21,75 g

Dinatriummonohydrogenorthophosphat dodecahydrat, Na2HPO4 . 12 H2O 44,60 g

Ammoniumchlorid, NH4Cl 1,70 g in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefuellt; der pH-Wert der Lösung sollte 7,2 betragen.

(b) Magnesiumsulfat heptahydrat, MgSO4 . 7 H2O 22,50 g in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefuellt.

(c) Calciumchlorid, wasserfrei, CaCl2 27,50 g in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefuellt.

(d) Eisen(III)chlorid hexahydrat, FeCl3 . 6 H2O 0,25 g in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefuellt.

Je 3 ml der Lösungen (a), (b), (c), (d) zusammengeben und auf 1 l auffuellen.

VII.2.3. Ansatz des Inokulums

Es sind frische Proben an mindestens zehn Orten zu entnehmen, vorzugsweise aus Gebieten, in denen eine Vielzahl chemischer Substanzen verwendet und eingetragen werden. An solchen Orten wie kommunalen Kläranlagen, Industriekläranlagen, Flüssen, Seen oder dem Meer sind 1-l-Proben Belebtschlamm, Oberboden, Wasser usw. zu entnehmen und gründlich zu durchmischen. Nach Entfernen aufschwimmender Stoffe wird die Probe stehengelassen und der Überstand mit Natronlauge oder Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 7 1 eingestellt.

Ein geeignetes Volumen des abfiltrierten Überstands wird in ein Belebtschlammgefäß gefuellt und etwa 23 1/2 h belüftet. Eine halbe Stunde nach Abschalten der Belüftung wird etwa ein Drittel des gesamten Überstands entnommen und das gleiche Volumen einer Lösung (pH 7), aus jeweils 0,1 % Glukose, Pepton und Kaliumorthophosphat, dem abgesetzten Material hinzugefügt und weiterbelüftet. Diese Schritte sind täglich zu wiederholen. Die Belebtschlammanlage ist unter Beachtung folgender Kriterien ordnungsgemäß zu betreiben: der Überstand sollte klar sein und einen pH-Wert von 7 1 aufweisen, die Temperatur sollte 25 2 C betragen, der Schlamm sollte sich gut absetzen, die Anlage sollte ausreichend belüftet werden, um die Mischung jederzeit ärob zu halten, es sollten Protozoa vorhanden sein, und die Aktivität des Schlamms sollte mindestens alle 3 Monate mit einer Referenzsubstanz überprüft werden. Vor Verwendung einer Schlammprobe als Inokulum muß die Anlage mindestens einen Monat, aber nicht länger als vier Monate in Betrieb gewesen sein. Danach sind in regelmässigen Abständen, alle 3 Monate, Proben an mindestens 10 Orten zu entnehmen.

Um frischen und alten Belebtschlamm bei gleicher Aktivität zu halten, wird der filtrierte Überstand des alten, bereits in der Prüfung verwendeten Belebtschlamms mit einem gleichen Teil Überstandsfiltrat einer frisch gewonnenen Mischung von zehn Orten gemischt. Die Gesamtmischung wird wie beschrieben weitergezuechtet. Als Inokulum sind Schlammproben erst 18-24 h nach Beschickung der

Anlage zu verwenden.

VII.2.4. Ansatz der Flaschen

Es sind folgende sechs Flaschen anzusetzen:

Nr. 1: 100 mg/l Prüfsubstanz in Verdünnungswasser

Nr. 2, 3 und 4: 100 mg/l Prüfsubstanz in mineralischem Medium

Nr. 5: 100 mg/l Referenzsubstanz (z. B. Anilin) in mineralischem Medium

Nr. 6: nur mineralisches Medium

Schwerlösliche Prüfsubstanzen werden gewichts- oder volumenbezogen direkt in die Flasche gegeben oder entsprechend Anhang III behandelt (mit der Abweichung, daß weder Lösungsmittel noch Emulgatoren verwendet werden dürfen). Das CO2-Absorbens wird allen Flaschen in die dafür vorgesehenen Behälter gegeben und der pH-Wert in den Flaschen Nr. 2, 3 und 4 auf 7,0 eingestellt.

VII.2.5. Durchführung der Prüfung

Die Flaschen Nr. 2, 3 und 4 (Prüfsuspensionen), Nr. 5 (Aktivitätsprüfung) und Nr. 6 (Inokulum-Blindversuch) werden mit einer geringen Menge Inokulum angeimpft, um eine Konzentration an suspendierten Feststoffen von 30 mg/l zu erhalten. Flasche Nr. 1, die als abiotische Kontrolle dient, erhält kein Inokulum. Anschließend ist die Versuchsanordnung aufzubauen, auf Luftabschluß zu prüfen, die Rührgeräte anzustellen und mit der Messung der Sauerstoffaufnahme im Dunkeln zu beginnen. Es sind tägliche Kontrollen der Temperatur, des Rührgerätes und des coulometrischen Registriergerätes für die Sauerstoffaufnahme vorzunehmen und eventuelle Farbänderungen des Flascheninhalts zu protokollieren. Die Sauerstoffaufnahme für die sechs Flaschen ist direkt mit Hilfe eines geeigneten Gerätes, zum Beispiel am Sechsfachschreiber abzulesen, der eine BSB-Kurve erzeugt. Am Ende der Inkubation, normalerweise nach 28 Tagen, sind die pH-Werte der Flascheninhalte zu messen und die Konzentration der restlichen Prüfsubstanz sowie möglicher Abbauprodukte und, im Falle wasserlöslicher Stoffe, die DOC-Konzentration zu bestimmen (Anhang II.4). Besondere Vorsicht ist bei fluechtigen Substanzen geboten. Ist eine Nitrifikation zu erwarten, sind - wenn möglich - Nitrat- und Nitritkonzentration zu bestimmen.

VII.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT

VII.3.1. Auswertung der Ergebnisse

Die Sauerstoffaufnahme (mg) durch die Prüfsubstanz nach einer vorgegebenen Zeit (korrigiert um die Sauerstoffaufnahme der Inokulum-Blindkontrolle nach der gleichen Zeit) ist durch die Menge der verwendeten Prüfsubstanz zu dividieren. Dadurch erhält man den BSB, angegeben als mg Sauerstoff pro mg Prüfsubstanz:BSB = mg O2-Aufn. Prüfsubst. mg O2-Aufn. Blindkontrollemg Prüfsubst. in der Flasche = mg O2 pro mg Prüfsubstanz

= mg O2 pro mg Prüfsubstanz

Der prozentuale biologische Abbau ist dann wie folgt zu berechnen:

% biolog. Abbau = % ThSB = BSB (mg O2/mg Prüfsubstanz) ThSB (mg O2/mg Prüfsubstanz) 100

Bei Mischungen ist der ThSB aus der Elementanalyse - wie für einfache Verbindungen - zu berechnen. Der zu verwendende ThSB-Wert (ThSBNH4 oder ThSBNO3) richtet sich danach, ob keine oder eine vollständige Nitrifikation stattgefunden hat (Anhang II.2). Bei auftretender, jedoch unvollständiger Nitrifikation, ist ein Korrekturfaktor für den durch die Nitrifikation verbrauchten Sauerstoff aus den Änderungen der Nitrit- und Nitratkonzentration zu berechnen (Anhang V).

Der prozentuale biologische Primärabbau wird aus dem Verlust an spezifischer (Ausgangs-)Substanz ermittelt (vgl. I.7,2.).

Dt = Sb SaSb 100 %

Wird in Flasche Nr. 1 bei der Bestimmung des physikalisch-chemischen Abbaus ein Verlust an Prüfsubstanz festgestellt, so ist dies zu protokollieren und die Konzentration der Prüfsubstanz (Sb) nach 28 Tagen in dieser Flasche zur Berechnung des prozentualen biologischen Abbaus zu verwenden.

Wenn DOC-Bestimmungen vorgenommen werden (wahlweise), dann ist der prozentuale biologische Endabbau entsprechend I.7.1. aus

Dt = 1 Ct Cbt Co Cbo 100

zu berechnen. Wird in Flasche Nr. 1 bei der Bestimmung des physikalisch-chemisch bedingten Abbaus eine Abnahme an DOC festgestellt, so ist die DOC-Konzentration in dieser Flasche zur Berechnung des prozentualen biologischen Abbaus zu verwenden.

Sämtliche Ergebnisse sind auf den beigefügten Datenblättern zu protokollieren.

VII.3.2. Gültigkeit der Ergebnisse

Die Sauerstoffaufnahme in dem Inokulum-Blindansatz liegt normalerweise bei 20-30 mg/l O2 und sollte nach 28 Tagen einen Wert von 60 mg/l nicht überschreiten. Bei Werten über 60 mg/l sollten die Daten und die Versuchsdurchführung kritisch überprüft werden. Liegt der pH-Wert ausserhalb des Bereichs 6-8,5 und der Sauerstoffverbrauch durch die Prüfsubstanz unter 60 %, ist der Test mit einer geringeren Konzentration an Prüfsubstanz zu wiederholen.

Vgl. auch I.5.2.

Wenn der aus dem Sauerstoffverbrauch berechnete prozentuale Abbau des Anilins nach 7 Tagen nicht mehr als 40 % und nach 14 Tagen nicht mehr als 65 % beträgt, wird der Test als ungültig betrachtet.

VII.3.3. Abschlußbericht

Vgl. I.8.

VII.4. DATENBLATT

Nachstehend ein Beispiel eines Datenblattes

MITI-(I)-TEST

1. LABOR

2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN

3. PRÜFSUBSTANZ

Name:

Konzentration der Stammlösung: ... mg/l auf Substanz bezogen

Anfangskonzentration im Medium, Co: ... mg/l auf Substanz bezogen

Volumen des Reaktionsgemisches, V: ... ml

ThSB: ... mg O2/l

4. INOKULUM

Entnahmeorte:

1) ...

2) ...

3) ...

4) ...

5) ...

6) ...

7) ...

8) ...

9) ...

10) ...

Konzentration der suspendierten Feststoffe im Belebtschlamm nach Akklimatisierung mit synthetischen Abwässern = ... mg/l

Menge Belebtschlamm pro Liter im Versuchsansatz = ... ml

Konzentration des Schlamms im Versuchsansatz = ... mg/l

5. SAUERSTOFFAUFNAHME: BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT

Verwendeter Respirometertyp: ...

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

6. KOHLENSTOFFANALYSE (wahlweise):

Kohlenstoffanalysator: ...

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

% DOC-Abnahme: a (b c)a 100

7. DATEN AUS DER SPEZIFISCHEN ANALYSE

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

% Abbau = Sb SaSb 100

Der prozentuale Abbau ist für die Flaschen a1, a2 bzw. a3 zu berechnen.

8. ANMERKUNGEN

Nach Möglichkeit ist die BSB-Zeit-Kurve beizufügen.

ANHANG I

ABKÜRZUNGEN UND DEFINITIONEN

DO: Gelöster Sauerstoff (Dissolved Oxygen) (mg/l) - Konzentration des in einer wäßrigen Probe gelösten Sauerstoffs.

BSB: Biochemischer Sauerstoffbedarf (g) - von den Mikroorganismen beim Abbau einer Prüfsubstanz verbrauchte Sauerstoffmenge; auch angegeben als g Sauerstoffaufnahme pro g Prüfsubstanz (vgl. Methode C.5).

CSB: Chemischer Sauerstoffbedarf (g) - bei der Oxidation einer Prüfsubstanz mit heissem, saurem Dichromat verbrauchte Sauerstoffmenge; Maß für die vorhandene Menge an oxidierbarer Substanz; auch angegeben als g Sauerstoffverbrauch pro g Prüfsubstanz (vgl. Methode C.6).

DOC: Gelöster organischer Kohlenstoff (Dissolved Organic Carbon ) - Menge an organischem Kohlenstoff, die in der Lösung vorliegt oder ein Filter mit 0,45 m Porengrösse passiert bzw. nach 15 Minuten Zentrifugieren bei 40 000 m/s 2 ( 4 000 g) im Überstand verbleibt.

ThSB: Theoretischer Sauerstoffbedarf (mg) - Gesamtmenge an Sauerstoff, die zur vollständigen Oxidation einer Substanz erforderlich ist; wird aus der Summenformel berechnet (siehe Anhang II.2); auch angegeben als mg Sauerstoffbedarf pro mg Prüfsubstanz.

ThCO2: Theoretisches Kohlendioxid (mg) - Kohlendioxidmenge, die sich rechnerisch aus dem bekannten oder gemessenen Kohlenstoffgehalt der Prüfsubstanz bei vollständiger Mineralisation ergibt; auch angegeben als mg Kohlendioxidentwicklung pro mg Prüfsubstanz.

TOC: Gesamter organischer Kohlenstoff (Total Organic Carbon) einer Probe - Summe des organischen Kohlenstoffs in Lösung und in Suspension.

IC: Anorganischer Kohlenstoff (Inorganic Carbon).

TC: Gesamtkohlenstoff (Total Carbon) - Summe des in einer Probe enthaltenen organischen und anorganischen Kohlenstoffs.

Biologischer Primärabbau:

durch biologische Prozesse in der chemischen Struktur einer Substanz herbeigeführte Veränderung, die zum Verlust spezifischer Eigenschaften dieser Substanz führt.

Biologischer Gesamtabbau (ärob):

der nach vollständiger Umsetzung durch Mikroorganismen erreichte Abbaugrad der Prüfsubstanz unter

Erzeugung von Kohlendioxid, Wasser, Mineralsalzen und neuen mikrobiellen Zellbestandteilen (Biomasse).

biologisch leicht abbaubar:

ein willkürlich festgelegter Begriff für eine Kategorie von chemischen Substanzen, die bestimmte Screening-Tests auf voll ständige biologische Abbaubarkeit durchlaufen haben; diese Tests sind so stringent, daß angenommen wird, daß diese Substanzen im aquatischen Milieu unter äroben Bedingungen schnell und vollständig biologisch abgebaut werden.

potentiell biologisch abbaubar:

ein Begriff für eine Kategorie von chemischen Substanzen, deren biologische Abbaubarkeit (primär oder vollständig) eindeutig in einem beliebigen, anerkannten Test auf biologische Abbaubarkeit nachgewiesen worden ist.

in einer Kläranlage abbaubar:

Eigenschaft chemischer Substanzen, im Verlauf der biologischen Abwasserbehandlung entfernt zu werden, ohne daß der normale Betrieb der Klärprozesse negativ beeinträchtigt wird. Im allgemeinen sind biologisch leicht abbaubare Substanzen in einer Kläranlage abbaubar, nicht aber alle potentiell abbaubaren Substanzen. Hier können auch abiotische Prozesse stattfinden.

Lag-Phase

in einem Abbaubarkeitstest die Zeit zwischen der Animpfung und dem Zeitpunkt, zu dem der prozentuale Abbau mindestens 10 % erreicht hat. Die Lag-Phase ist häufig sehr variabel und schwer reproduzierbar.

Abbauzeit

Zeit vom Ende der Lag-Phase bis zu dem Zeitpunkt, zu dem 90 % des maximalen Abbauwertes erreicht sind.10-Tage-Fenster der 10-Tage-Abschnitt, der unmittelbar auf das Erreichen von 10 % Abbau folgt.

ANHANG II

BERECHNUNG UND BESTIMMUNG GEEIGNETER SUMMENPARAMETER

Je nach der gewählten Methode werden bestimmte Summenparameter benötigt. Nachfolgend wird die Ableitung dieser Werte beschrieben. Die Verwendung dieser Parameter wird bei den einzelnen Methoden angegeben.

1. Kohlenstoffgehalt

Der Kohlenstoffgehalt wird aus der bekannten Elementzusammensetzung berechnet oder durch Elementanalyse der Prüfsubstanz bestimmt.

2. Theoretischer Sauerstoffbedarf (ThSB)

Der Theoretische Sauerstoffbedarf (ThSB) kann berechnet werden, wenn die Summenformel bekannt ist oder durch Elementaranalyse bestimmt wird. Für die Substanz

CcHhClclNnNanaOoPpSs

beträgt sie ohne Nitrifikation

ThSBNH4 = 16 (2 c + 1/2 (h cl 3 n) + 3 s + 5/2 p + 1/2 na o)MG mg/mg

bzw. mit Nitrifikation

ThSBNO3 = 16 (2 c + 1/2 (h cl) + 5/2 n + 3 s + 5/2 p + 1/2 na o)MG mg/mg

3. Chemischer Sauerstoffbedarf (CSB)

Der Chemische Sauerstoffbedarf (CSB) wird nach Methode C.6 bestimmt.

4. Gelöster organischer Kohlenstoff (DOC)

Gelöster organischer Kohlenstoff (DOC) ist per definitionem der organische Kohlenstoff, der bei Filtration einer chemischen Substanz oder Gemischs in Wasser durch ein Filter mit 0,45 m Porengrösse in dieser verbleibt.

Dazu werden Proben aus den Prüfgefässen entnommen und sofort im Filtrationsgerät unter Verwendung eines geeigneten Membranfilters filtriert. Die ersten 20 ml (diese Menge kann bei Verwendung kleiner Filter verringert werden) des Filtrats werden verworfen. 10-20 ml oder - bei Injektion - weniger (je nach der für den Kohlenstoffanalysator benötigten Menge) werden für die Kohlenstoffanalyse zurückbehalten. Die DOC-Konzentration wird mit Hilfe eines organischen Kohlenstoffanalysators bestimmt, der eine genaue Messung einer Kohlenstoffkonzentration von 10 % oder weniger der im Versuch verwendeten DOC-Ausgangs-Konzentration ermöglichen muß.

Filtrierte Proben, die am selben Arbeitstag nicht mehr analysiert werden können, können 48 h im Kühlschrank bei 2-4 C bzw. über längere Zeiträume bei Temperaturen unter 18 C aufbewahrt werden.

Anmerkungen:

Membranfilter sind häufig mit oberflächenaktiven Substanzen versehen, die ihnen hydrophile Eigenschaften verleihen. Daher kann der Filter bis zu mehreren mg löslichen organischen Kohlenstoff enthalten, der die Bestimmung der biologischen Abbaubarkeit beeinträchtigt. Um die oberflächenaktiven Substanzen sowie andere lösliche organische Verbindungen aus den Filtern zu entfernen, werden diese 3 jeweils 1 Stunde in deionisiertem Wasser gekocht. Danach können die Filter eine Woche in Wasser aufbewahrt werden. Bei Verwendung von Einwegfilterpatronen, ist jede einzelne darauf zu überprüfen, daß sie keinen löslichen organischen Kohlenstoff freisetzt.

Bestimmte Membranfilter haben die Eigenschaft, die Prüfsubstanz zu adsorbieren. Es wird daher empfohlen, die Filter in dieser Hinsicht zu überprüfen.

Anstelle der Filtration kann zur Differenzierung von TOC und DOC eine 15-minütige Zentrifugation bei 40 000 m/s 2 (4 000 g) vorgenommen worden. Allerdings ist dieses Verfahren bei einer Ausgangskonzentration PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Borax (0,05 mol.l 1) + NaOH (0,1 mol.l 1)

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

(1) ABl. Nr. L 383 vom 29. 12. 1992, S. 113.